[發明專利]一種用于檢測類鼻疽伯克霍爾德菌的組合物及其應用

有效

• 申請號: 202110306283.2
• 申請日: 2021-03-23
• 公開（公告）號: CN113046452B
• 公開（公告）日: 2022-02-25
• 發明（設計）人: 李倩;楊文波;鄧鈴;閆晶敏;饒承龍;王施偉;毛旭虎
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍陸軍軍醫大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 重慶志合專利事務所(普通合伙) 50210
• 代理人: 胡榮琿

本發明提供了一種用于檢測類鼻疽伯克霍爾菌的組合物及其應用，包含用于特異性擴增類鼻疽伯克霍爾德菌Ⅵ型分泌系統BPSS0109基因的引物對。本發明還提供了用于快速檢測類鼻疽伯克霍爾菌感染的診斷試劑盒。本發明能快速檢出樣本中是否含有類鼻疽伯克霍爾德菌，用時較少，縮短了鑒定時間，有助于類鼻疽伯克霍爾德菌感染的早期診斷和篩查。

技術領域

本發明涉及生物工程領域，特別涉及一種用于Real-time PCR檢測類鼻疽伯克霍爾德菌的引物組及其應用。

背景技術

類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderiapseudomallei，B.pseudomallei)可以引起人畜共患疾病類鼻疽。類鼻疽伯克霍爾德菌主要流行于東南亞以及澳大利亞北部，我國廣東、海南、香港、臺灣等地區為主要流行區域。類鼻疽臨床表現復雜多樣，包括局部膿腫、重癥肺炎和急性敗血癥等，容易被誤診為結核、肺膿腫等其他疾病，因此稱為“似百樣病”。若不及時診斷治療，錯過最佳診療時間會嚴重影響患者預后。

目前的檢測類鼻疽伯克霍爾德菌的實驗室診斷方法主要包括：細菌分離培養、血清學診斷、分子生物學方法以及蛋白質組學等技術。細菌分離培養耗費時間長，會延誤臨床的治療，生長的菌落由強烈的霉臭味，常常被認為是同屬的其他細菌如泰國伯克霍爾德菌、洋蔥伯克霍爾德菌或污染物而被丟棄(特別是在非流行區)。由于在急性感染早期血液中尚未產生相應的抗體，造成假陰性結果，血清學檢測多用于流行病學調查或者大規模樣本篩查。目前已報道的分子生物學方法主要是基于PCR方法以及環介導等溫擴增法，檢測靶基因包括16s rRNA以及三型分泌系統基因簇等，類鼻疽伯克霍爾德菌和泰國伯克霍爾德菌16srRNA序列差異只有1％，和鼻疽伯克霍爾德菌的16s rRNA序列幾乎相同，容易導致鑒定錯誤；普通PCR方法在反應結束后需要進一步地瓊脂糖凝膠電泳實驗分析結果，過程較為復雜，同時容易引起氣溶膠污染；基于三型分泌系統的環介導等溫擴增法容易形成氣溶膠污染實驗室，導致假陽性結果。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜方法由于目前商業化的質譜圖庫不全，容易導致鑒定錯誤，有待進一步發展。

類鼻疽患者就診時多為急性發病，常伴有敗血癥，常規病原體診斷手段為：血培養、涂片染色、平板劃線培養分離單個菌落，藥敏鑒定。從血培養到最終得到藥敏結果通常需要耗費2～3天，錯過患者最佳診療時間，而在沒有相關經驗時容易錯誤鑒定為污染物或同種屬的其他細菌，導致治療用藥錯誤使用，延誤患者病情。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術檢測時間長，誤診率高，容易產生污染等缺陷，提供一種用于檢測類鼻疽伯克霍爾菌的組合物，以滿足對類鼻疽伯克霍爾菌感染進行快速、準確的診斷的需求。

本發明首先提供了一種用于檢測類鼻疽伯克霍爾菌的組合物，包含用于特異性擴增類鼻疽伯克霍爾德菌Ⅵ型分泌系統BPSS0109基因的引物對。

在根據本發明的一個實施方案中，所述引物對和探針擴增得到的基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:4。

在根據本發明的一個實施方案中，所述引物對中上游引物的核苷酸序列為SEQ IDNO:1，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO:2。

在根據本發明的一個實施方案中，所述組合物中還包含用于顯示靶基因濃度的探針，所述探針結合有熒光報告基團；優選地，所述探針的5’端標記有熒光報告基團，3’端標記淬滅基團；更優選地，所述探針的熒光報告基團為FAM，所述淬滅為BHQ1；進一步優選地，所述探針的核苷酸序列為SEQ ID NO:3。

本發明還提供了上述組合物在制備用于檢測類鼻疽伯克霍爾菌感染的診斷試劑中的應用。

本發明進一步提供了一種用于檢測類鼻疽伯克霍爾菌感染的診斷試劑盒，包含上述的組合物。

在根據本發明的一個實施方案中，還包含DNA聚合酶溶液、dNTP溶液、MgCl₂溶液中的一種或多種。