[發(fā)明專利]副溶血性弧菌基因缺失弱毒株和重組副溶血性弧菌減毒活疫苗及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110305802.3
• 申請日: 2021-03-24
• 公開（公告）號: CN113061561B
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 潘建義;高智超;查振中;查銀河
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江洪晟生物科技股份有限公司;浙江理工大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;A61K39/106;A61P31/04;C12R1/63
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本發(fā)明公開了一種副溶血性弧菌基因缺失弱毒株以及以此為基礎(chǔ)的疫苗。本發(fā)明所述的副溶血性弧菌基因缺失弱毒株為不含有tdhA、vcrD1和vcrD2基因且外膜上高效表達lptD蛋白的菌株。本發(fā)明所述的疫苗為含有副溶血性弧菌基因缺失弱毒株和藥學(xué)上可以接受的稀釋液，所述的疫苗的含量為每頭份含菌株濃度為10⁸CFU，所述的稀釋液為過0.22μm濾膜的PBS緩沖液或過0.22μm濾膜的生理鹽水。本發(fā)明構(gòu)建的副溶血性弧菌基因缺失弱毒株的安全性實驗表明，該菌株的毒力顯著降低，對實驗動物無毒性；而該菌株的免疫保護性分析表明其具有高效的免疫保護作用，可以100％保護實驗動物免于死亡。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種副溶血性弧菌基因缺失弱毒株和重組副溶血性弧菌減毒活疫苗及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

弧菌的革蘭氏染色結(jié)果呈陰性，是一種嗜鹽細菌，廣泛存在于靠近河流以及海水的地區(qū)。由病原弧菌感染所引起的魚、蝦、貝類等的弧菌病是水產(chǎn)養(yǎng)殖動物最主要的細菌性疾病。目前，已發(fā)現(xiàn)有27種弧菌可引起弧菌病，其中以副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)最為常。副溶血性弧菌給人和各種生物帶來了潛在的危害，其不僅危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，使魚蝦感染細菌性疾病而死亡，造成巨大經(jīng)濟損失，同時也是我國主要的食源性致病菌。當前對弧菌病的預(yù)防和治療主要是投喂抗生素，但這種方出現(xiàn)了一定的缺陷，出現(xiàn)了藥物的殘留和菌體產(chǎn)生相應(yīng)的抗藥性兩大問題，這已成為影響危害人們身體健康和食品安全，從而也導(dǎo)致了水產(chǎn)的一些作物出現(xiàn)了劣質(zhì)和損失。

外膜蛋白(outermembraneprotein)主要由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生，位于細菌肽聚糖層的外部，是組成其細菌細胞壁的一種成分，是構(gòu)成細菌外膜的一種重要結(jié)構(gòu)，其在細菌中的含量很高，可達其胞質(zhì)外結(jié)構(gòu)全部組成的二分之一。作為外膜的主要組分，外膜蛋白在細菌的生命活動中起著重要作用，細菌正常形態(tài)的維持以及物質(zhì)的合成、細菌的抗藥性等都離不開它。某些病原菌外膜蛋白具有粘附素作用,有助于病原菌對宿主細胞的粘附；某些病原菌外膜蛋白還具有抗吞噬、抗補體及抗血清殺菌等作用，有助于病原菌逃避宿主的免疫防御，從而達到致病目的。因為外膜蛋白是細菌的最外側(cè)的結(jié)構(gòu)，所以在細菌侵襲宿主細胞時，各種不同的外膜蛋白可以與宿主細胞的表面蛋白或受體發(fā)生相互作用，介導(dǎo)病原菌對宿主細胞的感染，但同時，外膜蛋白也是最容易容易被宿主的免疫系統(tǒng)所識別并被免疫系統(tǒng)認作是抗原的一類蛋白，所以有些外膜蛋白可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生具有高度保護性的免疫應(yīng)答。因此，對于宿主來說，病原菌的外膜蛋白可能是具有重要保護作用的抗原，并且一些外膜蛋白在同屬不同種病原菌中高度保守，甚至一些蛋白在不同屬的細菌中也存在一定的保守性，在不同種或同種不同血清型菌株誘發(fā)的免疫應(yīng)答中可產(chǎn)生一定程度的交叉保護作用，因此，細菌的外膜蛋白也是最具潛力的疫苗靶點之一。目前，已有較多關(guān)于弧菌外膜蛋白的免疫原性的研究表明許多外膜蛋白具有良好的免疫原性，這些蛋白包括如OmpW,OmpV,OmpU,OmpK,PsuA, PvuA,VPA1435,VP0764,VPA1186,VP1061，VP2850等。先前的研究通過免疫蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)也發(fā)現(xiàn)lptD, LamB,OmpA,OmpK,OmpU,VP0802,VP1243以及VP0966等具有免疫原性。這些研究結(jié)果表明，外膜蛋白能夠有效的刺激機體產(chǎn)生特異性抗體。此外，還有研究表明，某些外膜蛋白還可對相應(yīng)病原菌的感染具有50-100％的免疫保護率，有些外膜蛋白還能夠顯著增強機體吞噬細胞的吞噬活性。

OMPs是在革蘭氏陰性細菌中運輸脂多糖的一系列具有特殊功能蛋白質(zhì)。它不僅是革蘭氏陰性細菌外膜的主要組分之一，脂多糖在細菌感染機體時也會發(fā)揮重要的作用。其結(jié)構(gòu)以及功能已經(jīng)被進一步的闡明，其致病機理也已經(jīng)得到了充分的解釋。近年發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陰性菌的脂多糖的跨膜轉(zhuǎn)運以及在外膜上的組裝是由一系列的轉(zhuǎn)運蛋白LptA-G蛋白質(zhì)復(fù)合物共同作用完成的。而存在于細菌膜上的跨膜蛋白lptD在另一個轉(zhuǎn)運蛋白LptE的作用下，將脂多糖轉(zhuǎn)運至細菌外膜，形成細菌外膜重要結(jié)構(gòu)。有研究證實在封閉了lptD 的作用后，細菌的生長收到了很大程度的抑制，因此，lptD膜蛋白被認為是革蘭氏陰性細菌存活的“命門”。因而lptD對細菌的生理功能和毒力均具有關(guān)鍵作用。目前，lptD蛋白的三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到解析(圖1)。