[發(fā)明專利]逆轉(zhuǎn)錄酶突變體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110304959.4
• 申請日: 2021-03-23
• 公開（公告）號: CN112695019B
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 沈小波;劉博旭;顧玲;柴常升
• 申請（專利權(quán)）人: 翌圣生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12Q1/686;C12Q1/70;C12R1/93
• 代理公司: 蘇州根號專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32276
• 代理人: 朱華慶

本發(fā)明提供一種MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體，在野生型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列（如SEQ ID No.1序列所示）中進行七個氨基酸位點的突變，氨基酸突變位點為：R205H；V288T；L304K；G525D；S526D；E531G；E574G。該突變體可以降低MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶對Taq DNA聚合酶的抑制作用，大大提高了一步法RT?qPCR的靈敏度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明專利涉及逆轉(zhuǎn)錄酶突變體及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

野生型的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶會和Taq DNA聚合酶相互作用，抑制Taq DNA聚合酶活性，從而大大降低了一步法RT-qPCR擴增效率。亟需一種可以提升檢測靈敏度的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，以滿足RNA病毒快速檢測的臨床需求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶突變體，在野生型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列（如SEQ ID No.1序列所示）中進行七個氨基酸位點的突變，氨基酸突變位點為：R205H、V288T、L304K、G525D、S526D、E531G和E574G。該突變體可以降低MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶對Taq DNA聚合酶的抑制作用，大大提高了一步法RT-qPCR的靈敏度。

本發(fā)明的另一目的是提供上述的逆轉(zhuǎn)錄酶突變體在進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的應(yīng)用，以及在提高一步法RT-qPCR擴增效率中的應(yīng)用。

其中在提高一步法RT-qPCR擴增效率中的應(yīng)用的步驟為：

（1）合成待測RNA病毒的特異性引物和熒光探針；

（2）在待測樣本中加入合成的引物和探針，和逆轉(zhuǎn)錄酶突變體和Taq DNA聚合酶，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)過程中檢測熒光強度。

優(yōu)選的，步驟（2）中在逆轉(zhuǎn)錄體系中還加入RNA酶抑制劑。

優(yōu)選的，步驟（2）中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：