[發明專利]逆轉錄酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 202110304959.4
• 申請日: 2021-03-23
• 公開（公告）號: CN112695019B
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 沈小波;劉博旭;顧玲;柴常升
• 申請（專利權）人: 翌圣生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12Q1/686;C12Q1/70;C12R1/93
• 代理公司: 蘇州根號專利代理事務所(普通合伙) 32276
• 代理人: 朱華慶

1.一種逆轉錄酶突變體，其特征在于：在SEQ ID No.1序列的基礎上進行七個氨基酸位點的突變，氨基酸突變位點為：R205H、V288T、L304K、G525D、S526D、E531G和E574G。

2.權利要求1所述的逆轉錄酶突變體在進行逆轉錄反應中的應用。

3.權利要求1所述的逆轉錄酶突變體在提高一步法RT-qPCR擴增效率中的應用。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于其步驟包括：

（1）合成待測RNA病毒的特異性引物和熒光探針；

（2）在待測樣本中加入合成的引物和探針，和權利要求1所述的逆轉錄酶突變體和TaqDNA聚合酶，進行逆轉錄反應，反應過程中檢測熒光強度。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于：步驟（2）中在逆轉錄體系中還加入RNA酶抑制劑。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于：步驟（2）中逆轉錄反應體系為：

組分	體積：μL
2×基礎Buffer	12.5
5U/μL 的Taq DNA聚合酶	0.2-0.6
10U/μL 的逆轉錄酶突變體	1-4
10U/μL 的RNasin Inhibitor	0.5-2
Primer/Probe mix	1
RNA模板	5
2O]]>	Up to 25μL

其中2×基礎Buffer的配比為：

組分	濃度
Tris-HCL pH8.5-9.0	40-200mM
2]]>	4-16mM
KCl	100-200mM

。

7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于：步驟（2）中逆轉錄反應的過程為：反應體系先在50℃保溫10min，然后溫度升高到95℃保溫5min，再進行95℃ 15sec、60℃30sec的循環，循環數為45，循環時在60℃下采集熒光。