[發明專利]一種基于分子動力學模擬的核酸適配體優化設計方法

有效

• 申請號: 202110304532.4
• 申請日: 2021-03-22
• 公開（公告）號: CN113129996B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 黃強;顏志超;劉建平;李園園;宋夢華
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: G16B5/00
• 分類號: G16B5/00;G16B35/00;G16B50/00;G16C10/00;C12N15/115
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;陸尤

本發明屬于核酸適配體設計技術領域，具體為一種基于分子動力學模擬的核酸適配體優化設計方法。本發明從SELEX技術篩選所得核酸適配體的3D結構出發，通過自發結合模擬獲得小分子結合核酸適配體所形成復合物的3D結構；并分析復合物的結構和關鍵結合位點，利用所得信息指導核酸適配體序列的截短優化。本發明已用于特異結合毒素TTX的核酸適配體TTX?27的優化設計中；該核酸適配體通過SELEX技術篩選所得，親和力為90.73nM。通過優化得到TTX?27的一個截短型核酸適配體(TTX?D2)，適配體序列截去13個堿基，采用MST實驗驗證該核酸適配體的親和力提高了2倍；說明本優化方法是合理且有效的。

技術領域

本發明屬于核酸適配體設計技術領域，具體涉及核酸適配體設計方法。

背景技術

核酸適配體是一段單鏈脫氧核糖核酸(ssDNA)，核糖核酸(RNA)，可通過折疊形成不同且復雜的二級或三級結構以較高親和力與特異靶標結合(1,2)。由于核酸適配體對靶標具有高特異性和高親和性，因此其也被稱為化學抗體，解離平衡常數(K_d)通常在皮摩爾至納摩爾范圍內。與抗體相比，得益于體外篩選的核酸適配體，合成簡單，運輸簡便，易于化學修飾，擁有更為廣闊的靶標分子，包括金屬離子、小分子、蛋白質、細胞和病毒等，故在醫學診斷和治療、生物傳感及檢測、藥物遞送等領域有重大潛力(3)。

核酸適配體主要由SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponentialenrichment, 指數富集配基進化)技術篩選得到，其基本原理(4)：在篩選之前，要合成一個包含多達10¹⁵個不同序列的單鏈寡核苷酸文庫，每一輪篩選分離出未結合序列，富集有親和力的核酸序列，通過多輪篩選后，得到具有高親和性和高特異性的寡核苷酸鏈即為該靶標分子的適配體。然而，傳統的SELEX技術需要經過數周乃至數月的時間才能獲得特定的候選適配體，命中率很低；除此之外，很多情況下，篩選得到的核酸適配體長度通常太長，導致合成成本較高，也存在冗余堿基序列，在檢測過程中易出現副反應，不利于工程化使用。

因此，急需提出一種post-SELEX (后SELEX)優化設計方法，以在保證結合活性的前提下，截短核酸適配體序列。但是目前多數結構剪裁方法大多采用試錯法隨機嘗試，尚無基于結構指導的理性設計方法。理論上，小分子結合核酸適配體所形成復合物的3D結構能夠通過X射線結晶衍射(X-ray Crystallography)(5)和核磁共振(NMR, Nuclear MagneticResonance)(6)實驗方法獲得。但是，核酸適配體具有較強的靈活性，這些方法難以大量應用，故采用計算方法建立結構模型以優化核酸適配體。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種采用分子動力學模擬，并基于復合物的結構進行截短設計的核酸適配體優化方法，記為post-SELEX優化方法。

本發明的另一目的是提供靶向TTX的核酸適配體TTX-27的截短型高親和力變異體(TTX-D2)。

本發明提出的基于分子動力學模擬的核酸適配體優化設計方法，采用自發結合模擬獲得靶標小分子結合核酸適配體所形成復合物的穩定結構，規避了核酸適配體因靈活性較強而難以通過實驗方法獲得其3D結構這一問題。隨后通過分析復合物的結構，理性地設計親和力不弱于原適配體并且序列更短的變體適配體，并采用分子對接的方法評估優化方案。為SELEX篩選所得的核酸適配體提供一種合理且有效的post-SELEX優化方法。本發明提供的基于單核苷酸分子對接的核酸適配體設計方法，具體步驟為：

第一步：進行分子對接，預測靶標分子與核酸適配體結合時的解離平衡常數。