[發明專利]一種基于分子動力學模擬的核酸適配體優化設計方法

有效

• 申請號: 202110304532.4
• 申請日: 2021-03-22
• 公開（公告）號: CN113129996B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 黃強;顏志超;劉建平;李園園;宋夢華
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: G16B5/00
• 分類號: G16B5/00;G16B35/00;G16B50/00;G16C10/00;C12N15/115
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;陸尤

1.一種基于分子動力學模擬的核酸適配體優化設計方法，其特征在于，具體步驟為：

第一步：進行分子對接，預測靶標分子與核酸適配體結合時的解離平衡常數；

其中，分子對接所用軟件為AutoDock分子對接軟件包，配體分子為靶標小分子，受體分子為靶標小分子核酸適配體；分子對接采用的算法為拉馬克遺傳算法LGA，該算法將遺傳算法和局部搜索結合在一起，遺傳算法用于全局搜索，局部搜索用于能量優化；對接方法采用半柔性對接，即在對接過程中，核酸適配體的構象不發生變化，而靶標小分子的構象在一定的范圍內變化；為了確保靶標小分子能夠充分搜索構象，將對接格子的長寬高均設置為150?；格點之間的間隔為0.375 ?，對接格子的中心為核酸適配體的幾何中心；

第二步：進行配體自發結合分子動力學模擬，以獲得穩定的靶標小分子結合核酸適配體所形成復合物的3D結構；

其中，靶標小分子的AMBER力場參數采用AmberTools自帶的Antechamber軟件包生成；同時采用GROMACS-5.1.4分子動力學軟件，AMBER99bsc1力場及SPC水模型對模擬體系進行建模；在模擬體系中，核酸適配體置于水盒子的中心，且距水盒子表面的最小距離為15 ?；為了與溶液環境保持一致，將插入金屬陽離子和相應的陰離子使溶液環境保持中性；模擬過程采用周期性邊界條件，靜電和范德華相互作用分別采用PME和Cut-off方法計算，截斷距離均為14 ?；所有化學鍵均受LINCS算法約束；其中，積分時間步長為1~3 fs；具體過程為：首先利用最陡下降算法對模擬系統進行能量最小化；然后采用v-rescale恒溫器控制系統平衡溫度，berendsen壓力耦合平衡壓強；最后，在md集成器中對體系進行時間長度不少于150 ns分子動力學模擬；

第三步：分析復合物的結構并截短核酸適配體；

在第二步中獲得了靶標小分子與核酸適配體的分子動力學模擬軌跡，根據軌跡中穩定結合狀態下的復合物結構，分析結合模式，將遠離結合部位的莖環序列截去，并利用mini-hairpin序列替代，獲得截短優化適配體；Mini-hairpin的莖狀結構含有3~4對互補的堿基對，環狀結構含有3~4個孤立的堿基；Mini-hairpin的3D結構通過Rosetta程序中的RNA 3Dstructure modeling模塊獲得；

第四步：利用分子對接評估優化方案；

通過分子對接，預測靶標小分子與截短型核酸適配體結合時的解離平衡常數，并與第一步中預測的靶標小分子與原核酸適配體結合時的解離平衡常數作比較，如果截短型核酸適配體解離平衡常數小于原核酸適配體解離平衡常數，表明優化設計初步成功；

其中，分子對接所用軟件為AutoDock分子對接軟件包，配體分子為靶標小分子，受體分子為截短型核酸適配體；分子對接采用的算法為拉馬克遺傳算法LGA；對接方法采用半柔性對接；將對接格子的長寬高均設置為150 ?；格點之間的間隔為0.375 ?，對接格子的中心為截短型核酸適配體的幾何中心；

第五步：采用微量熱泳動實驗檢測核酸適配體與靶標小分子的結合強度；

微量熱泳動利用分子的熱泳動現象，通過測量溫度梯度下，分子耦合時水化層、分子大小和電荷等微小變化引發的熱泳動變化，進而分析分子之間的相互作用；對于每一組MST實驗，設計16個靶標小分子的濃度用于16根毛細管，利用梯度稀釋法1:1稀釋靶標小分子，其中每根毛細管中核酸適配體的濃度固定；熒光標記于核酸適配體3’端；核酸適配體與靶標小分子的偶聯會影響熱泳動的過程，由此導致熱泳動之后熒光信號值的變化；通過測量在不同結合程度下，樣品溶液MST過程熒光變化信號，擬合得到關于該結合反應解離平衡常數K_d值。

2.根據權利要求1所述的基于分子動力學模擬的核酸適配體優化設計方法，其特征在于，其中，所述核酸適配體為TTX-27，所述靶標小分子為靶向河豚毒素TTX；優化得到核酸適配體，記為TTX-D2。

3.一種由權利要求1所述優化設計方法得到的核酸適配體。

4.一種由權利要求2所述優化設計方法得到的核酸適配體。