[發(fā)明專利]基于彩色組馬蹄蓮多個轉(zhuǎn)錄組序列所開發(fā)的SSR引物組及獲取方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110303017.4
• 申請日: 2021-03-22
• 公開（公告）號: CN113151545B
• 公開（公告）日: 2023-03-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 衛(wèi)尊征;周滌;王壹;王賢;熊敏
• 申請（專利權(quán)）人: 北京市農(nóng)林科學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京五洲洋和知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11387
• 代理人: 榮紅穎

本發(fā)明公開了一種基于彩色組馬蹄蓮多個轉(zhuǎn)錄組序列所開發(fā)的SSR引物組、獲取方法和應(yīng)用。本發(fā)明首先利用CandiSSR方法從彩色組馬蹄蓮三個品種轉(zhuǎn)錄組拼接序列中篩選多態(tài)性SSR引物，經(jīng)試驗驗證后確定百余個多態(tài)性SSR引物，之后再利用篩選出的35對具有高多態(tài)性的SSR引物對160余份彩色組馬蹄蓮品種進(jìn)行多態(tài)性分析。另外本發(fā)明還基于上述研究，通過最大化策略對160份彩色組馬蹄蓮的核心種質(zhì)進(jìn)行構(gòu)建，最終篩選出最佳的30個彩色組馬蹄蓮代表性親本，為今后彩色組馬蹄蓮核心親本的篩選、育種效率的提高以及自主知識產(chǎn)權(quán)新品種的加快培育提供良好的幫助。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子標(biāo)記技術(shù)，具體地，涉及一種基于彩色組馬蹄蓮多個轉(zhuǎn)錄組序列所開發(fā)的SSR引物組及獲取方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

近年來，第二代測序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用開始逐漸打破以往轉(zhuǎn)錄EST序列獲取困難和價格昂貴的瓶頸。以Illumina/Solexa Genome Analyzer、Roche/454FLX和AppliedBiosystems SOLID system為代表的測序技術(shù)平臺，通過捕捉新合成的末端的標(biāo)記確定DNA序列的邊合成邊測序方法，可以在極短的時間，以最低的成本獲取最大的數(shù)據(jù)量。雖然與傳統(tǒng)Sanger測序方法相比，第二代測序序列相對較短，會增加后繼序列拼接組裝等分析的難度和計算量，但其通量大，成本低和特別適合基因組較短的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物測序的特點給無參考基因組信息的物種獲得基因組信息帶來了福音。SSR是轉(zhuǎn)錄組拼接EST序列中存在的，以幾個核苷酸(多數(shù)為2-6個)為重復(fù)單位的一種功能性標(biāo)記，除具有分布廣的特點外，它還具有擴增位點專一、技術(shù)簡單、重復(fù)性好、通用性強和共顯性遺傳等特點(Ribaut,1998)。并且由于其同候選基因處于緊密連鎖水平以及開發(fā)過程簡單、費用低和效率高等優(yōu)點，其已成為花卉植物進(jìn)行諸如多樣性評價、群體進(jìn)化分析、分子標(biāo)記輔助育種等研究中首選的標(biāo)記類型。

目前已經(jīng)有多個球根花卉如百合(Lilium)、彩色組馬蹄蓮(Zantedeschia)和朱頂紅(Hippeastrum)等，先后利用第二代測序技術(shù)開展各種組織或器官的轉(zhuǎn)錄組測序工作，并且開始從獲得的拼接序列中開展SSR引物的開發(fā)及應(yīng)用研究。如Yuan et al.(2013)篩選了494對引物百合引物對16個譜系進(jìn)行擴增驗證，其中172對有擴增多態(tài)性；但是Du et al.(2015)則利用包含二堿基和三堿基493對引物對32個百合譜系進(jìn)行擴增驗證時，僅有163對有擴增條帶，57對有多態(tài)性；Wei et al.(2016)通過隨機篩選的200對引物對21個彩色組馬蹄蓮譜系分析，確認(rèn)有137對有擴增產(chǎn)物，而58對有多態(tài)性；Wang et al.(2018)通過對朱頂紅隨機篩選的335對引物在17個品種多樣性擴增，共確認(rèn)154對有擴增條帶，98對有多態(tài)性。但是通過以上的比較可以知道，SSR引物的擴增效率在40-60％之間，而篩選出的具有多態(tài)性標(biāo)記更是在20-30％之間。其實擴增效率低，多態(tài)性標(biāo)記數(shù)量少等問題，同樣也發(fā)生在其它植物SSR引物開發(fā)中。這雖然與SSR主要來源于編碼基因，相對保守有關(guān)，但是同樣也與以上的標(biāo)記開發(fā)僅利用單個的或少量的拼接轉(zhuǎn)錄組序列有關(guān)。

與基因組SSR(gSSRs)相比，SSRs來源于轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域，其大多數(shù)存在于功能基因中，因此可能與某些重要的表型相關(guān)，這也為它進(jìn)行物種間轉(zhuǎn)移和獲得更普遍一致的擴增效率提供無法替代的潛在優(yōu)勢(Scott et al.,2000；Gupta et al.,2003)。一般上SSR多態(tài)性標(biāo)記開發(fā)主要由三個獨立的步驟組成，包括SSR位點的發(fā)現(xiàn)、引物設(shè)計和代表性群體或個體的多態(tài)性檢測。傳統(tǒng)的SSR位點的發(fā)現(xiàn)是昂貴的并且耗時的，需要通過SSR富集的文庫構(gòu)建和候選克隆測序(Sargent et al.,2003)，然后再進(jìn)行后續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠電泳和/或熒光毛細(xì)管電泳驗證。而如今第二代高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展已使SSR位點的發(fā)現(xiàn)和鑒定非常容易。然而我們?nèi)孕枨逍训恼J(rèn)識到，由于SSR位點來源于序列相對保守的基因編碼區(qū)，其多態(tài)性肯定較差，所以如何從轉(zhuǎn)錄組序列中所存在的動輒上千個的SSR位點中，快速有效地篩選到大量的既有功能性又有多態(tài)性的候選標(biāo)記位點就顯得異常嚴(yán)峻和有挑戰(zhàn)性。