[發明專利]一種利用磁珠探針快速檢測環介導等溫擴增核酸產物的方法

在審

• 申請號: 202110302845.6
• 申請日: 2021-03-22
• 公開（公告）號: CN112795630A
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 梁重陽;徐抒平;孫非;關鑫;徐冰
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 吉林省中玖專利代理有限公司 22219
• 代理人: 姜姍姍

本發明提供了一種利用磁珠探針快速檢測環介導等溫擴增核酸產物的方法，可用于與核酸鑒定相關的諸多領域，其根據環介導等溫擴增產物的單鏈環狀區域設計一段與其互補的磁珠探針，將其與待檢核酸混合并進行環介導等溫擴增反應，磁珠探針識別并結合擴增產物，磁分離后在紫外燈透射下可直接觀察熒光，判斷檢測樣品是否為陽性。本發明大大降低了原有環介導等溫擴增最大缺陷即假陽性率高的缺點，同時該方法穩定準確，特異性強，操作簡便快捷，整個檢測過程不需要昂貴的精密設備，降低成本，具有廣闊的市場前景。

技術領域

本發明屬于生物技術核酸檢測領域，具體涉及一種利用磁珠探針快速檢測環介導等溫擴增核酸產物的方法。

背景技術

目前病原體DNA、RNA的檢測主要依賴于PCR技術和qPCR技術，PCR、qPCR雖然能夠快速，敏感的檢測核酸，但由于其需要昂貴的設備，大大限制了其使用，尤其是在基層醫療機構。而環介導等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)因為其溫度恒定，設備簡單，操作便捷近些年來備受人們的關注。LAMP需要4-6個引物，經過30-60min后，可將少量核酸擴增至千百萬份。與傳統PCR相比，LAMP靈敏度更高，比傳統PCR高10到100倍，有時甚至單拷貝核酸也可以通過LAMP擴增。LAMP過程中所需溫度條件比較穩定，不需要反復的變溫，因此所需時間少。最重要的是LAMP過程中不需要復雜昂貴的儀器設備，符合基層和現場病原檢測工作的需要。但是LAMP極易產生假陽性結果，這主要是因為LAMP產物氣溶膠極易污染環境以及體系中過多的DNA引物可能會形成引物間的非特異性互補而產生假陽性結果。

發明內容

本發明目的在于提供一種利用磁珠探針快速檢測環介導等溫擴增核酸產物的方法，旨在解決現有環介導等溫擴增檢測特定核酸序列時，假陽性率高，檢測結果不準確的問題。

本發明的目的通過如下技術方案實現：

一種利用磁珠探針快速檢測環介導等溫擴增核酸產物的方法，包括如下步驟：

S1、設計待檢測樣本環介導等溫擴增引物和制備與待檢測樣本特異性結合的磁珠探針；

S2、將所述的環介導等溫擴增引物與緩沖液與DNA聚合酶預混，加入待檢測樣本，加溫進行反應后得到環介導等溫擴增產物；

S3、將所述的磁珠探針加入到所述的環介導等溫擴增產物，孵育；

S4、等溫擴增液洗滌磁珠，再加入雙鏈DNA染料，孵育；

S5、觀察檢測信號，判斷所述的待測樣本是否為陽性。

作為本發明更優的技術方案，所述磁珠探針為根據環介導等溫擴增產物的單鏈環狀結構設計互補的單鏈探針，將該探針修飾于磁珠表面，用于結合環介導等溫擴增產物。LAMP產物中的莖環樣結構和多環花椰菜樣結構中存在很多單鏈環狀DNA結構，根據該單鏈環狀結構設計與之互補的單鏈DNA探針，DNA探針與磁珠結合形成磁珠探針，通過熒光判斷樣品中是否存在目標核酸。

作為本發明更優的技術方案，所述磁珠探針中的磁珠為但不限于具有超順磁性的磁珠。

作為本發明更優的技術方案，所述的待測樣本為來自病原體的基因樣本。

作為本發明更優的技術方案，所述的病原體的基因樣本為病原體DNA樣本或是來自于病原體的RNA逆轉錄樣本。

作為本發明更優的技術方案，步驟S5中的所述的檢測信號為紫外燈下得到的熒光信號。

作為本發明更優的技術方案，步驟5還包括設置陰性對照組，所述的陰性對照組為無目標核酸序列的待測樣本，有熒光或較強，則結果判斷為陽性，沒有熒光，則結果判斷為陰性。

本發明還提供將所述的利用磁珠探針快速檢測環介導等溫擴增核酸產物的方法應用于檢測目標核酸序列中。