[發明專利]一種檢測人體液中DHEA的含量的方法

在審

• 申請號: 202110298486.1
• 申請日: 2021-03-19
• 公開（公告）號: CN113063866A
• 公開（公告）日: 2021-07-02
• 發明（設計）人: 蔡俊;吳建軍
• 申請（專利權）人: 蘇州倍樂勇生物科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/72;G01N30/04;G01N30/06;G01N30/86;G01N30/88;G01N30/34
• 代理公司: 深圳得本知識產權代理事務所(普通合伙) 44762
• 代理人: 袁江龍

1.一種檢測人體液中DHEA的含量的方法，包括高效液相色譜串聯質譜技術檢測唾液中脫氫表雄酮，其特征在于：

S1、在試劑盒中加入以下試劑，流動相一、流動相二、標準品母液、內標液、稀釋液、萃取液、質控品和復溶溶劑；

S2、采用高效液相色譜串聯質譜技術檢測經過前處理的唾液中脫氫表雄酮；

S3、利用高效液相色譜將脫氫表雄酮與干擾物分離；

S4、利用同位素內標法定量；

S5、以標準品與內標物的濃度比為X軸，標準品與內標物峰面積比為Y軸；

S6、建立標準曲線，計算待測樣本中脫氫表雄酮的含量。

2.根據權利要求1所述的一種檢測人體液中DHEA的含量的方法，其特征在于，所述流動相一為體積比為0.1％甲酸水溶液，所述流動相二為色譜純的乙腈；

所述標準品母液為脫氫表雄酮的乙腈溶液，精確稱取10mg脫氫表雄酮標準品，用乙腈溶解定容至10ml，得到1mg/ml標準品母液；

所述內標液為d6-脫氫表雄酮的乙腈溶液，精確稱取10mg d6-脫氫表雄酮標準品，用乙腈溶解定容至10ml，得到1mg/ml內標母液。

所述稀釋液包括稀釋液一和稀釋液二，稀釋液1：空白唾液基質溶液，將0.4g氯化鈉，0.4g氯化鉀，0.8g二水氯化鈣，0.8g二水磷酸二氫鈉，1g尿素，3g牛血清白蛋白用水溶解定容至1L制得，所述稀釋液二為乙腈；

所述萃取液為甲基叔丁基醚；

所述質控品為脫氫表雄酮的空白唾液基質溶液，分低QC(L)、中QC(M)、高QC(H)濃度，濃度分別為：20pg/ml、100pg/ml、500pg/ml，取10μl脫氫表雄酮標準品母液，用稀釋2定容至100ml，得100ng/ml的脫氫表雄酮標準溶液；

QC(L)：取2μl 100ng/ml的脫氫表雄酮標準溶液，用稀釋液一定容至10ml；

QC(M)：取10μl 100ng/ml的脫氫表雄酮標準溶液，用稀釋液一定容至10ml；

QC(H)：取50μl 100ng/ml的脫氫表雄酮標準溶液，用稀釋液1定容至10ml；

所述復溶溶劑為體積比為60％乙腈水溶液。

3.根據權利要求1所述的一種檢測人體液中DHEA的含量的方法，其特征在于，流動相一：體積比為0.1％的甲酸水；流動相二：乙腈，純度為色譜純；濃度為100％；色譜柱型號：Waters XBridge BEH C18，3.5μm,2.1mm*150mm；

采用梯度洗脫方式；

流速為0.2ml/min，柱溫為40℃，進樣體積為10μl。

表1流動相梯度洗脫參數。

4.根據權利要求1所述的一種檢測人體液中DHEA的含量的方法，其特征在于，所述高效液相色譜串聯質譜技術的質譜條件為：在電噴霧電離正離子檢測模式下，采用多反應監測(MRM)的質譜掃描模式；噴霧電壓為5500V；碰撞氣為8；氣簾氣為20psi；離子源溫度為650℃；離子源氣流GS1為70psi；GS2為50psi；目標物脫氫表雄酮m/z 318.1→253.1，同位素內標d6-脫氫表雄酮m/z 324.1→253.1；脫氫表雄酮及內標的去簇電壓(DP)、射入電壓(EP)、碰撞電壓(CE)、碰撞室射出電壓(CXP)參數見表2。

表2脫氫表雄酮及內標的質譜參數。

5.根據權利要求1所述的一種檢測人體液中DHEA的含量的方法，其特征在于，所述經前處理的唾液按照如下方法制備得到：取唾液500μl于2ml離心管中，加入2.5ng/ml的內標溶液20μl，加入1ml萃取液，渦旋震蕩5min，13000r/min離心10min，轉移有機相至另一2ml離心管，氮氣吹干，向吹干離心管中加入衍生劑，避光水浴反應，反應完成后向離心管中加入100μl水，再加入1ml萃取液，渦旋振蕩5min，轉移有機相至另一2ml離心管，重復上述操作再萃取一次，合并兩次有機相；氮氣吹干，以100μl 60％乙腈水復溶，渦旋1min；13000r/min離心5min取上清，進樣10μl上機檢測。