[發明專利]一種基于σ因子作為轉錄元件的無細胞蛋白質合成方法

在審

• 申請號: 202110297055.3
• 申請日: 2021-03-19
• 公開（公告）號: CN113046380A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 盧元;林曉媚
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/435
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 陳波

本申請提供了一種基于細胞內源σ因子的，用于大腸桿菌無細胞蛋白質合成的方法，其特征在于：所述方法利用大腸桿菌或枯草芽孢桿菌內源的σ因子以及對應的啟動子組成的蛋白表達基因元件在無細胞蛋白合成體系中進行蛋白質表達。

技術領域

本發明屬于合成生物學蛋白合成領域，具體涉及一種用于無細胞蛋白質合成表達元件的方法。

背景技術

在過去的幾十年中，隨著代謝工程和合成生物學的發展，微生物作為生產多種多樣的(生物)化學品生產工廠，展現出巨大的潛力和應用前景。而無細胞蛋白合成(cell-free protein synthesis，CFPS)是一種新型的蛋白合成技術，在生物類產品生產上相比于全細胞工廠有著其合成的優勢。這種技術主要是利用細胞提取物中轉錄翻譯相關的催化酶組分聯合外添加的能量再生系統，蛋白合成氨基酸底物，無機鹽和輔因子等進行體外的蛋白質合成。無細胞合成能夠在體外完成蛋白合成過程，而不需要活細胞的參與。因為沒有細胞膜的限制，這個合成體系更加可控制，可以外添加特定試劑輔助蛋白的合成，例如通過調整氧化還原化合物的比例來促進二硫鍵的合成，添加表面活性劑及納米圓盤等協助膜蛋白的合成，添加非天然氨基酸為蛋白進入特定的基團等。除此之外，無細胞體系的DNA模板不受限于環形的表達質粒或者基因組，純化的線性DNA產物亦能在無細胞體系中有較高的表達效率。另外，無細胞體系中由于不涉及細胞生長，可以表達毒性蛋白。基于以上無細胞系統的優勢，近年來有許多合成生物學相關應用被開發，包括傳感器，藥物制造，大分子生產，能源與儲能，生物材料及人工細胞等技術。

盡管無細胞蛋白合成體系已發展六十余年，但是其可用的基因元件仍十分匱乏，主要是依賴噬菌體T7及T7 RNA聚合酶在體系中進行轉錄翻譯。有限的噬菌體轉錄元件限制了無細胞體系中基因電路的開發及復雜體系的應用。近幾年有相關研究利用大腸桿菌σ因子開發可用于無細胞蛋白合成體系的表達元件。此研究證明了內源性的表達元件在無細胞中的應用潛力。基于σ因子的表達系統主要是細胞內一類可以與核心酶結合形成聚合酶全酶后識別啟動子中保守序列的轉錄因子，而啟動子中非保守序列則會影響表達強度。在自然界中，σ因子及其啟動子組成了龐大的轉錄元件庫。而基于細胞提取物的無細胞體系中由于保留了大部分細胞中轉錄翻譯的酶組分體系，在細胞提取物中便有足夠的核心酶等轉錄元件。因此多種σ因子及其不同強度的啟動子可以被發開利用在無細胞體系中。另外除了大腸桿菌中有σ因子系統，某些革蘭氏陽性菌例如枯草芽孢桿菌，或革蘭氏陰性菌谷棒桿菌中也有此轉錄系統。并且在物種間的核心酶功能口袋具有保守型，因此其余物種的σ因子仍適用于大腸桿菌無細胞體系。

發明內容

盡管已經有研究開發了基于σ因子的轉錄元件用于無細胞體系，但此開發仍是有限的，仍不能滿足無細胞體系面對不同調控的需求。另外對于調控型的表達，調控元件與被調控元件之間需要有較好的正交性，即一個啟動子只能被一種轉錄因子調控表達。因此需要開發更多的可用于無細胞體系并具有正交性表達元件。而自然界中的σ因子及其啟動子仍有許多元件及在無細胞中的應用仍未被挖掘。表達調控元件在調控與被調控之間需要背景低以及調控專一性強等特點，所以外源枯草芽孢桿菌的元件庫也是其中一種選擇。

另外為了節省DNA模板設計構建的時間，使得無細胞體系更加適用于基因電路的設計及篩選工作，在無細胞中可以利用PCR純化后的線性DNA作為模板進行蛋白表達與篩選。由于沒有質粒構建過程，不僅僅減少設計構建時間，還可以避免σ因子在構建過程中的表達而影響宿主細胞大腸桿菌生長的問題。