[發明專利]一種基于σ因子作為轉錄元件的無細胞蛋白質合成方法

在審

• 申請號: 202110297055.3
• 申請日: 2021-03-19
• 公開（公告）號: CN113046380A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 盧元;林曉媚
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/435
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 陳波

1.一種基于細胞內源σ因子的，用于大腸桿菌無細胞蛋白質合成的方法，其特征在于：所述方法利用大腸桿菌或枯草芽孢桿菌內源的σ因子以及對應的啟動子組成的蛋白表達基因元件在無細胞蛋白合成體系中進行蛋白質表達。

2.根據權利要求1所述的方法，其中σ因子表達DNA模板及啟動子與目的蛋白DNA模板以線性PCR產物形式添加到無細胞蛋白合成體系中進行蛋白表達。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述方法中所使用的無細胞蛋白合成體系為基于大腸桿菌細胞提取物的無細胞體系。

4.根據權利要求1-3任一項所述的方法，其中的σ因子選自大腸桿菌σ因子σ²⁴、σ²⁸、σ³²、σ³⁸、σ⁵⁴、σ⁷⁰、枯草芽孢桿菌σ因子σ^A、σ^B、σ^D、σ^E、σ^F、σ^G、σ^H、σ^K、σ^W、σ^X和/或σ^L。

5.根據權利要求1-4任一項所述的方法，其中啟動子為能夠被σ因子特定識別并且啟動轉錄的大腸桿菌調控型啟動子P_24a、P_24b、P_24c、P_24d、P_28d、P_32a、P_32b、P_32c、P_32d、枯草芽孢桿菌調控型啟動子P_Bb、P_Bc、P_Be、P_Da、P_Db、P_Dc、P_Ea、P_Eb、P_Ec、P_Fd、P_Fe、P_Gc、P_Gd、P_Hd，或者不需要添加轉錄因子即可進行蛋白轉錄的組成型啟動子P_70f、P_Ac、P_He。

6.根據權利要求1-5任一項所述的方法，其中利用組成型啟動子P70表達σ因子，σ因子與對應序列的啟動子特異識別并且啟動轉錄的過程。

7.一種基于細胞內源σ因子的，用于大腸桿菌無細胞蛋白質合成的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)設計利用組成型啟動子P70表達σ因子的表達模板，并PCR擴增所述表達模板；

(2)利用σ因子對應的啟動子設計可調控的基因電路進行目的蛋白的表達；

(3)組裝好無細胞體系后加入所述表達模板，同時或者可控時間加入對應啟動子調控的目的基因表達的模板進行無細胞蛋白表達反應；無細胞反應表達一段時間后，可監測表達特性，產物特性或者所探究的生理特性。