[發(fā)明專利]雙熒光團的酶測定法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110296502.3
• 申請日: 2014-10-24
• 公開（公告）號: CN113073129A
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 沃德·C·塔克
• 申請（專利權(quán)）人: 拜奧麥迪遜公司
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37
• 代理公司: 北京華夏正合知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11017
• 代理人: 韓登營

本發(fā)明公開了提供用于酶活性的快速、靈敏和準(zhǔn)確的基于細(xì)胞的測定的組合物和方法，特別是用于與肉毒桿菌毒素相關(guān)聯(lián)的酶活性。本發(fā)明提供了一種表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)胞，其中所述構(gòu)建體包括錨定域、切割位點，和具有兩個或多個相同的報告肽的報告域。酶活性在切割位點將報告域釋放進(jìn)入其中發(fā)生多個降解事件的胞質(zhì)溶膠。在信號中所觀察到的變化與酶活性成正比。

本申請是申請?zhí)枮椤?01480067579.1”、發(fā)明名稱為“雙熒光團的酶測定法”、申請日為“2014年10月24日”的專利申請的分案申請。

本申請要求享有美國臨時申請61/895533(2013年10月25日提交)，美國臨時申請61/897352(2013年10月30日提交)，美國臨時申請62/014586(2014年6月19日提交)，以及美國臨時申請為62/058532(2014年10月1日提交)的優(yōu)先權(quán)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明的領(lǐng)域為蛋白酶測定法，特別是那些涉及肉毒桿菌(Clostridiumbotulinum)神經(jīng)毒素的蛋白酶測定法。

技術(shù)背景

肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BoNTs)由肉毒桿菌產(chǎn)生，其是已知的最強的毒素之一。這些毒素是公認(rèn)的食物中毒的來源，往往導(dǎo)致受害者的嚴(yán)重?fù)p傷甚至死亡。有許多結(jié)構(gòu)類似的肉毒桿菌神經(jīng)毒素或血清型(BoNT/A-G和被提出的BoNT/H)，每一個由一個重鏈(大約100KD)和一個輕鏈(大約50kD)組成。重鏈通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用介導(dǎo)毒素進(jìn)入靶細(xì)胞。一旦進(jìn)入內(nèi)部，輕鏈從內(nèi)體小泡腔轉(zhuǎn)移入胞質(zhì)溶膠，并且充當(dāng)依賴鋅的蛋白酶(zinc-dependentprotease)來切割介導(dǎo)囊泡—靶膜融合的底物特異性蛋白，所述囊泡—靶膜融合的這一過程是神經(jīng)遞質(zhì)釋放的中心。

BoNT底物蛋白包括細(xì)胞膜蛋白突觸融合蛋白(syntaxin)，外周膜蛋白SNAP-25和囊泡膜蛋白小突觸泡蛋白(synaptobrevin，Syb)。這些蛋白被統(tǒng)稱為SNARE(可溶性N-乙基馬來酰亞胺—敏感因子附著蛋白受體)蛋白。SNARE蛋白的切割阻止了囊泡與細(xì)胞膜的融合，且消除了神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)肌肉接頭的釋放。在SNARE蛋白中，突觸融合蛋白和SNAP-25通常存在于靶膜上，從而被稱為t—SNARE，而小突觸泡蛋白只與突觸內(nèi)的突觸小泡相關(guān)聯(lián)，從而被稱為v-SNARE。這三種蛋白一起形成的復(fù)合體被認(rèn)為是介導(dǎo)囊泡膜和質(zhì)膜之間融合所需的最小機構(gòu)。BoNT/A,BoNT/E,和BoNT/C切割SNAP-25，而BoNT/B,BoNT/D,BoNT/F和BoNT/G在單個且不同的位點上切割小突觸泡蛋白(Syb)。除了SNAP-25，BoNT/C也切割突觸融合蛋白。由于BoNT充當(dāng)酶起作用，甚至微小的量都會對受影響的個體造成破壞性的影響。

雖然肉毒桿菌神經(jīng)毒素是食物中毒的來源，并具有用作生物恐怖主義武器的潛在威脅，但肉毒桿菌神經(jīng)毒素也有治療性的應(yīng)用。最近，肉毒桿菌神經(jīng)毒素已用于治療與不希望的肌肉收縮(如斜視)有關(guān)的病癥，并用于持續(xù)的偏頭痛的治療。它也被廣泛地用于化妝品用途，其中皮下小肌肉的選擇性麻痹能暫時減少與年齡相關(guān)的皺紋的出現(xiàn)。伴隨著如此廣泛的用途，存在對靈敏且快速地鑒定BoNT蛋白的需要。這個過程由于需要準(zhǔn)確定量BoNT活性，而不是簡單地定量BoNT蛋白質(zhì)存在的量而變得復(fù)雜，如用于分離這些蛋白的純化過程能夠?qū)е嘛@著程度的變性以及導(dǎo)致這些蛋白質(zhì)的失活。

目前，一個常用的用來檢測BoNTs和定量它們的活性的方法是使用小鼠進(jìn)行毒力測定。這種方法需要使用大量的小鼠，耗時，且不能用于進(jìn)行毒素催化動力學(xué)的研究。也已經(jīng)開發(fā)了許多基于針對BoNT蛋白的抗體的免疫測定系統(tǒng)，但即使這樣的測定可用于定量存在的BoNT蛋白的量，它們也不能用來確定毒素的酶活性。為了檢測這些毒素的酶活性，已開發(fā)多種方法，以檢測BoNT的反應(yīng)產(chǎn)物，例如，使用HPLC或使用針對切割產(chǎn)物的免疫測定法。然而這些方法中一般復(fù)雜耗時，并且可能是昂貴的(例如，利用專門的抗體)，這使得它們難以實現(xiàn)自動化并且不適用于大規(guī)模篩選。