[發明專利]雙熒光團的酶測定法

在審

• 申請號: 202110296502.3
• 申請日: 2014-10-24
• 公開（公告）號: CN113073129A
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發明（設計）人: 沃德·C·塔克
• 申請（專利權）人: 拜奧麥迪遜公司
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37
• 代理公司: 北京華夏正合知識產權代理事務所(普通合伙) 11017
• 代理人: 韓登營

1.用于鑒定至少一個肉毒桿菌神經毒素BoNT蛋白酶的酶活性的基于細胞的測定法的細胞包括：

蛋白水解酶；以及

報告構建體，包括

i)膜錨定域，其包含與細胞膜形成復合物的第一肽；

ii)報告域，其包括包含與綠色熒光蛋白的序列具有至少80％序列同源性的熒光蛋白的至少兩個第二肽，其中第一個所述第二肽產生第一波長的第一信號，第二個所述第二肽產生第一波長的第二信號，其中所述報告域產生集合信號，所述集合信號為所述第一信號和所述第二信號的累加；

iii)切割位點，其包括第三肽，所述切割位點插入任意兩個所述膜錨定域與所述至少兩個第二肽之間，

其中第三肽構造為當所述報告構建體暴露于所述酶活性時會經歷切割事件，

其中所述熒光蛋白選擇為易受所述切割事件之后的細胞胞質溶膠中的蛋白水解的影響，

其中所述集合信號在失去所述第一信號或所述第二信號中的任何一個時仍能被觀察到；

其中所述第二肽選自由YFP和eYFP組成的組。

2.根據權利要求1所述的細胞，其中第一個所述第二肽易受細胞胞質溶膠中的第一降解事件的影響，第二個所述第二肽易受在切割事件之后的細胞胞質溶膠中的第二降解事件的影響，其中所述第一降解事件導致所述第一信號的產生的損失，所述第二降解事件導致所述第二信號的產生的損失。

3.根據權利要求1所述的細胞，其還包括插入第一個所述第二肽與第二個所述第二肽之間的接頭肽。

4.根據權利要求1所述的細胞，其中所述綠色熒光蛋白具有SEQ ID NO.10的序列。

5.根據權利要求1所述的細胞，其中所述第三肽是SNARE蛋白。

6.根據權利要求1所述的細胞，其還包括輔助報告域，其提供第二波長的信號，其中第二波長可與所述第一波長區分。

7.根據權利要求1所述的細胞，其中相對于包含單個所述第二肽的報告構建體，所述報告構建體示出第一BoNT蛋白酶的酶活性和第二BoNT蛋白酶的酶活性之間的減小的敏感性偏差，其中所述第三肽配置為當所述構建體暴露于所述第一酶活性或所述第二酶活性時經歷切割事件。

8.根據權利要求7所述的細胞，其中所述第一BoNT蛋白酶為BoNT/A，所述第二BoNT蛋白酶為BoNT/E。

9.根據權利要求1所述的細胞，其中所述報告構建體表現出等于或小于5％的熒光劑之間的能量傳遞。