[發明專利]一種提高酰基輔酶A表達量的方法及其在發酵生產螺旋霉素過程中的應用

在審

• 申請號: 202110296427.0
• 申請日: 2021-03-19
• 公開（公告）號: CN113005164A
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 高淑紅;張憲花;賈佳;梁培培;李圣愷
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12P19/62
• 分類號: C12P19/62;C12N1/38;C12R1/465
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 吳林松

本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種提高酰基輔酶A合成相關基因轉錄水平和?；o酶A含量來增加螺旋霉素產量的方法。方法包括：(1)將菌種冷凍保藏管接種在種子培養基中；(2)將種子培養液轉接至發酵培養基中，發酵培養，并在菌體發酵培養0h?120h向培養液中加入?；o酶A合成前體；(3)加入?；o酶A合成前體后菌體至少培養24h；(4)收集步驟(3)獲得菌體，進行酰基輔酶A合成基因轉錄水平和?；o酶A含量分析。本發明還包括這些方法在用放線菌生產大環內酯類次級代謝物過程中的應用。本發明的方法操作簡易、成本低廉，能夠大幅增加?；o酶A的合成量，使得螺旋霉素工業高產株的產量進一步提高。

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種提高?；o酶A合成相關基因轉錄水平和?；o酶A含量從而提高螺旋霉素產量的方法。

背景技術

螺旋霉素(Spiramycin)是一種由生二素鏈霉菌(Streptomyces ambofaciens)或螺旋鏈霉菌(Streptomyces spiramyceticus)產生的16元大環內酯類抗生素，其化學結構主要由一個16元內酯環以及其上所連接的兩個氨基糖福洛氨糖(Forosamine)、碳霉氨糖(Mycaminose)和一個中性糖碳霉糖(Mycarose)組成^[1-2]。螺旋霉素通過與細菌50S核糖體的大亞基特異性連接，在空間上阻斷細菌新生肽鏈的延伸，從而達到抑菌效果，因其較強的抗菌活性及持續的抗生素后效性，已廣泛應用于臨床感染性疾病的治療^[3-6]。依據C-3位原子的酰化程度不同，將螺旋霉素分為未被?；穆菪顾丌?、乙酰化的螺旋霉素Ⅱ和丙酰化的螺旋霉素Ⅲ^[7]。其中螺旋霉素I生物效價較高，約是螺旋霉素II、III的1.8倍和1.4倍^[8]。螺旋霉素Ⅰ的分子結構如下所示。

螺旋霉素的產生過程中，16元環的生成通常被認為是主要的限制性因素。聚酮合酶Ⅰ (PKS)體系可催化基本?；鶈卧把娱L單為聚合成內酯。前體物質短鏈脂肪酸可在酶的催化作用下轉化成內酯環生成所需的基本?；o酶A單元，通常認為酰基輔酶A的生成是產生螺旋霉素大環的重要前體^[9]。螺旋霉素的內酯環合成是以乙酰輔酶A為起始單元，在聚酮合酶的作用下7個延伸單元：4個丙二酰輔酶A，1個乙基丙二酰輔酶A，1個甲基丙二酰輔酶A 和一個甲氧基丙二酰-?；d體蛋白，合并成16元內酯環^[10]。圖1是螺旋霉素合成路徑圖。

圖2為乙酰輔酶A、丙二酰輔酶A、甲基丙二酰輔酶A、乙基丙二酰輔酶A的合成路徑圖。乙酰輔酶A由丙酮酸經丙酮酸脫氫酶(PDH)代謝生成，或乙酸在?；o酶A合成酶(ACS)的作用下生產，以及脂肪酸代謝生成。丙二酰輔酶A由丙二酸經過丙二酰輔酶A合成酶(MCS)和乙酰輔酶A經過乙酰輔酶A羧化酶(ACC)代謝生成。乙基丙二酰輔酶A由乙酰輔酶A代謝生成巴豆酰輔酶A或者巴豆酸經過?；o酶A合成酶(ACS)生成巴豆酰輔酶A，巴豆酰輔酶 A再經過巴豆酰輔酶A還原酶(CCR)生成乙基丙二酰輔酶A。甲基丙二酰輔酶A由琥珀酸經琥珀酸連接酶生產琥珀酰酰基輔酶A，再由琥珀酰輔酶A經過甲基丙二酰輔酶A變位酶(MCM) 代謝生成甲基丙二酰輔酶A；或者由支鏈氨基酸代謝及丙酸、丁酸代謝生成甲基丙二酰輔酶A 半醛，接著進一步生成代謝生成甲基丙二酰輔酶A；或由丙酸、乙基丙二酰輔酶A代謝生成丙酰輔酶A，再經過丙酰輔酶A羧化酶(PCC)作用生成甲基丙二酰輔酶A。