[發(fā)明專利]一種提高酰基輔酶A表達(dá)量的方法及其在發(fā)酵生產(chǎn)螺旋霉素過(guò)程中的應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110296427.0
• 申請(qǐng)日: 2021-03-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113005164A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高淑紅;張憲花;賈佳;梁培培;李圣愷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P19/62
• 分類號(hào): C12P19/62;C12N1/38;C12R1/465
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 吳林松

1.一種提高酰基輔酶A相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平和酰基輔酶A含量以增加螺旋霉素產(chǎn)量的方法，所述的方法包括如下步驟：

(1)將冷凍保藏的合成酰基輔酶A和螺旋霉素的菌種接種在種子培養(yǎng)基中,27.0±2℃培養(yǎng)24-50h；

(2)按照2％-12％的接種量將種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，26.0±2℃發(fā)酵培養(yǎng)132h-156h，并在細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)0h-120h向培養(yǎng)液中加入酰基輔酶A合成前體；

(3)加入酰基輔酶A合成前體后菌體至少培養(yǎng)24h；

(4)收集步驟(3)獲得菌體，進(jìn)行酰基輔酶A合成基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)和酰基輔酶A含量分析；

所述的酰基輔酶A合成相關(guān)基因包括但不限于：丙酮酸脫氫酶基因、酰基輔酶A合成酶基因、丙二酰輔酶A合成酶基因、巴豆酰輔酶A還原酶基因、琥珀酰輔酶A連接酶基因、甲基丙二酰輔酶A變位酶基因中的一種或者幾種。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括測(cè)定螺旋霉素效價(jià)的步驟。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，收集步驟(2)中發(fā)酵48h-156h的菌體發(fā)酵液，測(cè)定螺旋霉素效價(jià)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，檢測(cè)酰基輔酶A合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的步驟是使用聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)所述的檢測(cè)酰基輔酶A合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酰基輔酶A合成前體包括但不限于：丙二酸、巴豆酸、乙酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、丁酸、丙酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，加入酰基輔酶A合成前體的時(shí)間為菌體發(fā)酵接種后培養(yǎng)0-120小時(shí)。

7.一種提高酰基輔酶A產(chǎn)量的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1的方法提高細(xì)胞中酰基輔酶A合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)胞內(nèi)酰基輔酶A的含量增加。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的酰基輔酶A包括但不限于乙酰輔酶A、丙二酰輔酶A、甲基丙二酰輔酶A、乙基丙二酰輔酶A。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，檢測(cè)酰基輔酶A含量的步驟是使用UPLC-MS或者UPLC-MS/MS檢測(cè)酰基輔酶A的含量。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，對(duì)合成酰基輔酶A的細(xì)菌使用權(quán)利要求1的方法，以提高酰基輔酶A的含量。

11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的合成酰基輔酶A的細(xì)菌包括但不限于生二素鏈霉菌、螺旋霉素鏈霉素、吸水鏈霉菌、紅霉糖多孢菌。

12.權(quán)利要求1-6中任意一種方法的應(yīng)用，其特征在于，使用權(quán)利要求1-6中任意一種方法培養(yǎng)生產(chǎn)酰基輔酶A的菌體，提高酰基輔酶A的含量。

13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的生成酰基輔酶A的菌體同時(shí)能夠產(chǎn)生螺旋霉素。

14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其特征在于，使用權(quán)利要求1-6中任意一種方法大規(guī)模培養(yǎng)通過(guò)酰基輔酶A合成螺旋霉素的菌種，以提高螺旋霉素的產(chǎn)量。

15.一種生產(chǎn)螺旋霉素的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1-6中任意一種方法培養(yǎng)合成螺旋霉素的菌種，所述的螺旋霉素是螺旋霉素I，其結(jié)構(gòu)如下所示：

16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述的菌種選取生二素鏈霉菌。