[發(fā)明專利]一種抗凍蛋白及其制備方法和應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2021-03-19
• 公開（公告）號: CN112876545A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 廖麗;高山惠;陳波;胥義
• 申請（專利權(quán)）人: 中國極地研究中心（中國極地研究所）;上海理工大學
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C12N15/70;C12N1/21;A23L3/3526;C12R1/19
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本發(fā)明公開了一種抗凍蛋白及其制備方法和應(yīng)用，屬于微生物抗凍蛋白技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過對從北極海冰中分離獲得的細菌BSI20414基因組序列分析發(fā)現(xiàn)一個巨型粘附蛋白，從該蛋白序列中預測出一個抗凍結(jié)構(gòu)域，利用基因工程手段對該結(jié)構(gòu)域序列進行克隆表達，獲得可溶性重組蛋白，經(jīng)活性研究發(fā)現(xiàn)，該重組蛋白具有較高抗凍活性，具有抑制冰晶生長與重結(jié)晶功能，在結(jié)構(gòu)保護和細胞保護等方面具有應(yīng)用潛力，為低溫保護劑開發(fā)提供候選。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物抗凍蛋白技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種北極海冰細菌來源的抗凍蛋白及其在低溫保護方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)

冰凍圈約占地球總表面積的13%，主要分布在南北兩極及高山冰川等區(qū)域，絕大部分時間均處于零度以下低溫。此外，地球上其他地區(qū)也會季節(jié)性經(jīng)歷低溫冰凍，而冰凍會導致冰晶的形成，影響細胞滲透壓并對細胞產(chǎn)生物理損傷，給生命帶來致命損害。極地海冰是一類極端的海洋生境，其溫度、鹽度和營養(yǎng)物質(zhì)梯度變化顯著，且由于冰晶的存在，對生存其中的生命而言極具挑戰(zhàn)。由于特殊適應(yīng)機制，海冰微生物得到科研和工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域廣泛的關(guān)注(Wang, Salem et al. 2019)。其中，抗凍蛋白便是一種重要的低溫生存機制，不僅具有重要的研究價值，而且在生產(chǎn)實踐中具有廣泛的應(yīng)用空間。

抗凍蛋白是一類能夠與冰晶吸附結(jié)合而改變冰晶生長狀態(tài)、抑制重結(jié)晶的蛋白質(zhì)，能非依數(shù)性降低溶液冰點，具有熱滯活性、抑制冰重結(jié)晶性、修飾冰晶形態(tài)等特性（Bia?kowska et al., 2020）。抗凍蛋白作為新型低溫保護劑，在低溫生物行業(yè)、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力巨大。隨著低溫生物技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等的快速發(fā)展，亟需對稀有菌毒種資源、人類細胞、器官和組織，以及各類種質(zhì)資源實現(xiàn)高質(zhì)量保存，就需要探索安全、高效、綠色的低溫保護劑方案。因此，獲得廉價、功能優(yōu)良、具有生產(chǎn)潛力的抗凍蛋白意義重大。

研究最早也最成熟的是動物來源的抗凍蛋白，例如魚類抗凍蛋白和昆蟲抗凍蛋白。抗凍蛋白最先由加拿大科學家從南極海域中一種名為Nototheneniid的魚類血清中分離（Devries and Wohlschlag, 1969）。在植物中也發(fā)現(xiàn)存在抗凍蛋白，但活性不如昆蟲抗凍蛋白。細菌抗凍蛋白的發(fā)現(xiàn)比動物抗凍蛋白晚了近30年，目前對細菌抗凍蛋白的認識還不是很清楚，但細菌抗凍蛋白的優(yōu)勢明顯，例如具有高度多樣性、來源廣泛、活性較好、克服了魚類抗凍蛋白的腥味、以及來源可持續(xù)、成本低且適合工業(yè)放大生產(chǎn)。因此，細菌抗凍蛋白逐漸成為抗凍蛋白的重要研究和開發(fā)應(yīng)用對象。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種具有抑制冰晶形成以及重結(jié)晶活性的抗凍蛋白，將其應(yīng)用于細胞的低溫保護，為細胞低溫保護劑開發(fā)提供候選。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明通過對從北極海冰中分離獲得的細菌BSI20414基因組序列分析發(fā)現(xiàn)一個巨型粘附蛋白，從該蛋白序列中預測出一個結(jié)構(gòu)域，跟已知的M. primoryensis的抗凍蛋白結(jié)構(gòu)域氨基酸序列相似性86.5%。利用基因工程手段對該結(jié)構(gòu)域序列進行克隆表達，獲得可溶性重組蛋白，經(jīng)活性研究發(fā)現(xiàn)，該重組蛋白具有較高抗凍活性，濃度為1 mg/ml時熱滯活性為-0.15℃。

因此，本發(fā)明提供了一種抗凍蛋白，由如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或插入一個或多個氨基酸所獲得的具有同等活性的蛋白質(zhì)。

具體地，可通過現(xiàn)有的體外表達體系對所述抗凍蛋白進行生產(chǎn)制備，例如大腸桿菌表達系統(tǒng)。

本發(fā)明提供了一種編碼所述的抗凍蛋白的基因序列，所述編碼基因包含核心序列，所述核心序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

具體地，將所述核心序列克隆到表達質(zhì)粒中，利用表達質(zhì)粒攜帶的起始密碼子、終止密碼子實現(xiàn)抗凍蛋白的表達。表達質(zhì)粒自身攜帶的標簽序列使得表達出的融合蛋白中攜帶標簽，有助于重組蛋白的分離純化。