[發(fā)明專利]一種OXLD1基因過表達的細胞株及其構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110295366.6
• 申請日: 2021-03-19
• 公開（公告）號: CN113201498B
• 公開（公告）日: 2023-06-13
• 發(fā)明（設計）人: 閆妍;趙曉靜;崔賽嘉;陳卉寧;韓洋;田留洋
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍總醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/12;C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 北京領科知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(特殊普通合伙) 11690
• 代理人: 徐丹丹;張丹

本發(fā)明提供了一種OXLD1基因過表達的細胞株及其構(gòu)建方法，以及構(gòu)建細胞株的過表達載體及其構(gòu)建方法。構(gòu)建出的細胞株能夠長期持續(xù)穩(wěn)定過表達大鼠OXLD1，避免瞬時感染基因表達持續(xù)時間短且不穩(wěn)定的缺陷。同時，彌補現(xiàn)有技術中對于OXLD1基因在細胞能量代謝方面研究的空白以及推動對于線粒體功能的研究。

技術領域

本發(fā)明涉及細胞生物技術領域，具體涉及一種OXLD1基因過表達細胞株的構(gòu)建方法。

背景技術

線粒體結(jié)構(gòu)損傷與心功能障礙有著密不可分的聯(lián)系，維持線粒體結(jié)構(gòu)正常，人工增加其表達可能是一種新的治療方法。OXLD1(Oxidoreductase-Like?Domain-ContainingProtein1)預測其與線粒體復合物V組裝因子相互作用，與線粒體氧化呼吸功能相關，在決定心功能方面有著十分重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)線粒體復合物V組裝因子參與細胞應激反應(例如參考文獻：Inoue?N等，Unbiased?compound?screening?with?a?reporter?geneassay?highlights?the?role?of?p13?in?the?cardiac?cellular?stress?response，Biochem?Biophys?Res?Commun，2018，495(2):1992-1997)。

OXLD1基因在細胞能量代謝方面研究還存在空白，故本申請構(gòu)建了OXLD1基因過表達的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，其長期持續(xù)穩(wěn)定過表達OXLD1，對于線粒體功能的研究具有推動作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種OXLD1基因過表達的細胞株，所述的細胞株的染色體上包含OXLD1基因。

優(yōu)選的，所述的OXLD1基因可以來源于大鼠、蜥蜴或斑馬魚。進一步優(yōu)選來源于大鼠。

在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述的OXLD1基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

優(yōu)選的，所述的細胞株為心肌細胞，例如來源于人或非人動物的心肌細胞，進一步優(yōu)選為大鼠心肌細胞系。

在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述的細胞株為大鼠心肌細胞系H9C2細胞。

優(yōu)選的，所述的細胞株中穩(wěn)定過表達OXLD1基因。

優(yōu)選的，所述的細胞株可以為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或瞬時轉(zhuǎn)染后偶然篩選獲得。

本發(fā)明還提供了上述細胞株的構(gòu)建方法。其選自磷酸鈣法、脂質(zhì)體介導法或病毒介導法等可以制備穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的方法。

優(yōu)選的，所述的構(gòu)建方法包括：

a)構(gòu)建包含OXLD1基因的過表達載體；

b)將步驟a)所述的過表達載體轉(zhuǎn)染至H9C2細胞；優(yōu)選的，所述的轉(zhuǎn)染為使用Lipofectamine?3000進行轉(zhuǎn)染。

c)抗性篩選獲得OXLD1基因過表達的細胞株。

在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述的構(gòu)建方法包括：

a)構(gòu)建包含OXLD1基因的過表達載體，將過表達載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細菌，培養(yǎng)并提取過表達載體的質(zhì)粒；

優(yōu)選的，獲得OXLD1基因的方法包括利用包含兩個酶切位點的引物對，PCR擴增OXLD1基因。進一步優(yōu)選的，所述的酶切位點為XhoI和KpnI。

優(yōu)選的，所述的酶切反應體系為XhoI用量為6-20U，KpnI用量為8-20U，酶切反應緩沖液為10×，OXLD1用量為1-3μg，載體用量為1-3μg。酶切反應體系體積為20-50μL。

步驟2.3將連接反應的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Stbl3感受態(tài)細菌，涂布氨芐抗性的LB平板，優(yōu)選的37℃倒置培養(yǎng)18小時，將菌落PCR陽性的菌落進行小搖，保菌并提取質(zhì)粒。