[發(fā)明專利]一種用于去除生物納米顆粒中內(nèi)毒素的層析介質(zhì)的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110295336.5
• 申請日: 2021-03-19
• 公開（公告）號: CN113000039B
• 公開（公告）日: 2023-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張榮月;王仕杰;靳海波;何廣湘
• 申請（專利權(quán)）人: 北京石油化工學(xué)院
• 主分類號: B01J20/285
• 分類號: B01J20/285;B01J20/28;B01J20/30
• 代理公司: 北京凱特來知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11260
• 代理人: 鄭立明;李闖

本發(fā)明公開了一種用于去除生物納米顆粒中內(nèi)毒素的層析介質(zhì)的制備方法，它是將含有兩種反應(yīng)單體和一種交聯(lián)劑的油相組分混勻后加入到預(yù)先升溫至聚合溫度的水相中，攪拌并保持該溫度進(jìn)行聚合，從而得到多孔微球；將改性多糖類單體通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)所述多孔微球表面接枝，從而得到表面接枝有聚多糖親水中性阻拒層的多孔微球；將內(nèi)毒素親和配基與所述多孔微球表面的環(huán)氧基團(tuán)反應(yīng)，從而制得用于去除生物納米顆粒中內(nèi)毒素的層析介質(zhì)。本發(fā)明不僅操作步驟簡單、反應(yīng)過程易控，而且所制得的層析介質(zhì)具有體積排阻和親和色譜雙重功能，能夠快速高效去除生物納米顆粒中的內(nèi)毒素，對提高生物納米顆粒生產(chǎn)效率具有重要的應(yīng)用意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及聚合物層析填料的制備技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于去除生物納米顆粒中內(nèi)毒素的層析介質(zhì)的制備方法。

背景技術(shù)

內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的成分，在疫苗、抗體藥物等蛋白類生物制品的制備過程中，表達(dá)宿主菌的破裂難免帶來內(nèi)毒素污染。內(nèi)毒素又稱為“熱源”，一旦過量的內(nèi)毒素進(jìn)入人體血液循環(huán)，就會(huì)由內(nèi)毒素引起一系列信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)而誘發(fā)膿毒血癥、膿毒性休克、全身炎癥反應(yīng)綜合征等危及生命的疾病。我國藥典規(guī)定注射用藥品最大內(nèi)毒素含量小于0.5EU/mL，因此，在生物制品生產(chǎn)中，內(nèi)毒素要求嚴(yán)格去除至達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求。

層析法是生物制品生產(chǎn)中常用的去除內(nèi)毒素方法之一，如陰離子交換層析、疏水相互作用、凝膠過濾、親和等色譜模式，主要是通過內(nèi)毒素與介質(zhì)之間的靜電作用、疏水作用或二者結(jié)合的相互作用來去除內(nèi)毒素，這些方法能夠達(dá)到去除內(nèi)毒素的目的，但同時(shí)由于內(nèi)毒素與其他蛋白分子的電荷、疏水性等相近，因此，該類介質(zhì)在吸附內(nèi)毒素的同時(shí)，大量的目標(biāo)蛋白與之進(jìn)行競爭吸附，導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率減低。除此之外，當(dāng)前常用的層析介質(zhì)多以瓊脂糖微球?yàn)榛|(zhì)，其特點(diǎn)為孔徑小(30～50nm)、質(zhì)地軟(耐壓小于0.3MPa)，而對于一些大尺寸的生物納米顆粒，其平均直徑常達(dá)百納米以上，如病毒顆粒(20～400nm)、病毒樣顆粒(20～200nm)、質(zhì)粒DNA(至少100nm)、細(xì)胞外囊泡(20～5000nm)等，其體積尺寸大、擴(kuò)散系數(shù)小于常規(guī)蛋白分子(平均直徑小于10nm)，但其表面的電荷、疏水性等化學(xué)性質(zhì)通常與內(nèi)毒素分子相似，故僅能吸附于常規(guī)介質(zhì)表面，吸附后的該類生物納米顆粒一方面會(huì)阻塞層析介質(zhì)表面孔道而致使小尺寸的內(nèi)毒素分子(其單體分子量常在100Kd以下)無法進(jìn)入介質(zhì)而被捕獲，另一方面由于其本身陷入介質(zhì)孔道后，洗脫過程中易解聚而失活，從而造成目標(biāo)產(chǎn)物收率降低同時(shí)內(nèi)毒素去除效率下降。隨著近年來該類生物納米顆粒在疫苗生產(chǎn)、基因治療、細(xì)胞治療等領(lǐng)域的需求量迅速增長，迫切需要規(guī)模化生產(chǎn)高質(zhì)量的該類生物納米顆粒，因此，針對生物納米顆粒體系中的內(nèi)毒素去除問題，開發(fā)更高效的內(nèi)毒素去除層析介質(zhì)尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足之處，本發(fā)明提供了一種用于去除生物納米顆粒中內(nèi)毒素的層析介質(zhì)的制備方法，不僅操作步驟簡單、反應(yīng)過程易控，而且所制得的層析介質(zhì)具有體積排阻和內(nèi)毒素親和雙重功能，克服了現(xiàn)有常用層析介質(zhì)在生物納米顆粒中去除內(nèi)毒素效率低的瓶頸問題，能夠快速高效去除生物納米顆粒中的內(nèi)毒素，對提高生物納米顆粒生產(chǎn)效率具有重要的應(yīng)用意義。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種用于去除生物納米顆粒中內(nèi)毒素的層析介質(zhì)的制備方法，包括以下步驟：

步驟1、通過懸浮聚合方法制備多孔微球基質(zhì)：將含有兩種反應(yīng)單體和一種交聯(lián)劑的油相組分混勻后加入到預(yù)先升溫至聚合溫度的水相中，攪拌并保持該溫度進(jìn)行聚合，從而得到多孔微球；

步驟2、通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)表面接枝親水中性阻拒層：將改性多糖類單體通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)所述多孔微球表面接枝，從而得到表面接枝有聚多糖親水中性阻拒層的多孔微球；其中，所述的改性多糖類單體為甲基丙烯酸縮水甘油酯改性的多糖分子、乙烯基單體改性的多糖分子中的至少一種；

步驟3、偶聯(lián)內(nèi)毒素親和配基：將內(nèi)毒素親和配基與所述表面接枝有聚多糖親水中性阻拒層的多孔微球表面的環(huán)氧基團(tuán)反應(yīng)，從而制得用于去除生物納米顆粒中內(nèi)毒素的層析介質(zhì)。