[發(fā)明專(zhuān)利]5-氨基乙酰丙酸合成酶突變體及其宿主細(xì)胞和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110293111.6
• 申請(qǐng)日: 2018-03-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112831483B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-11-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭平;趙晶;譚子瑊;陳久洲;饒德明;孫際賓;馬延和
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/10;C12N15/54;C12N1/21;C12P13/00;C12R1/19;C12R1/15
• 代理公司: 上海一平知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31266
• 代理人: 崔佳佳;馬莉華

本發(fā)明提供一種5?氨基乙酰丙酸合成酶(ALA合成酶)，所述ALA合成酶的氨基酸序列在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第40位、第365位、第75位、第29位、第44位的氨基酸殘基發(fā)生了突變。本發(fā)明的ALA合成酶不僅顯著提高了活性，同時(shí)也部分解除了血紅素的反饋抑制。同時(shí)，本發(fā)明還提供了制備和改造該酶的方法，含有該酶的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞以及該酶在ALA生產(chǎn)中的應(yīng)用。

本申請(qǐng)是2018年03月08日提交的，申請(qǐng)?zhí)枮?01810191516.7，發(fā)明名稱(chēng)為“5-氨基乙酰丙酸合成酶突變體及其宿主細(xì)胞和應(yīng)用”的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及5-氨基乙酰丙酸合成酶的突變體及其宿主細(xì)胞和應(yīng)用。

背景技術(shù)

5-氨基乙酰丙酸(5-minolevulinic acid，ALA)是生物體合成血紅素、葉綠素、VB12等四吡咯化合物的前體，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中。ALA在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、飼料和保健食品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，是極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的高附加值生物基化學(xué)品。目前ALA主要通過(guò)化學(xué)合成法生產(chǎn)，原料成本和污染物排放量高，導(dǎo)致其生產(chǎn)成本高昂，限制了其在農(nóng)業(yè)、飼料等領(lǐng)域的規(guī)模化應(yīng)用。近年來(lái)，通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)ALA已經(jīng)得到了產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。ALA的生物合成途徑主要有兩條，一條是在ALA合成酶的作用下以琥珀酰CoA和甘氨酸為前體合成ALA，稱(chēng)為C4途徑，另一條是以谷氨酰tRNA為前體通過(guò)兩步反應(yīng)合成ALA，稱(chēng)為C5途徑。由于只涉及一步酶促催化反應(yīng)，目前C4途徑被廣泛用于ALA高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建。

ALA合成酶是C4途徑合成ALA以及四吡咯化合物的關(guān)鍵酶和限速酶，其酶學(xué)性質(zhì)的好壞直接影響ALA合成的效率。近年來(lái)，包括放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter，CN1322132C)、嗜酸柏拉紅菌(Rhodoblastus acidophilus，CN1974758B)、類(lèi)球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides，CN103146694B)、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris，CN103981203B)等大量不同來(lái)源的ALA合成酶被克隆鑒定并用于ALA高產(chǎn)菌株的構(gòu)建。然而，上述ALA合成酶均為不同生物體內(nèi)天然存在的酶源，本身酶學(xué)性質(zhì)存在熱穩(wěn)定性差(Meng et al.Biotechnology Letters,2015,37(11):2247-2253)和受終產(chǎn)物血紅素反饋抑制(Zhang et al.Biotechnology Letters,2013,35(5):763-768)等問(wèn)題，限制了其在工業(yè)微生物領(lǐng)域中的應(yīng)用。嗜熱菌來(lái)源的ALA合成酶雖然具有較高的熱穩(wěn)定性，但是其比活力或底物親和力則大幅低于上述常用的ALA合成酶，(Meng etal.Biotechnology Letters,2015,37(11):2247-2253)難以在工程菌中應(yīng)用。

近年來(lái)，隨著酶工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的快速發(fā)展，通過(guò)理性設(shè)計(jì)提高酶的催化活性等性質(zhì)已被廣泛應(yīng)用。但是目前關(guān)于在ALA合成酶的理性設(shè)計(jì)和改造方面的研究并不多，僅有的報(bào)道主要涉及真核生物來(lái)源的ALA合成酶，Turbeville等將兩個(gè)小鼠來(lái)源的ALA合成酶融合表達(dá)后可提高其催化效率(Turbeville et al.Archives of BiochemistryBiophysics,2011,511(1):107-117)，Lendrihas等通過(guò)構(gòu)建小鼠紅細(xì)胞中ALA合成酶II的突變體庫(kù)，篩選得到了酶活提高的ALA合成酶突變體(Lendrihas et al.Journal ofBiological Chemistry,2010,285(18):13704)。上述研究雖然獲得了酶活提高的ALA合成酶，但并未研究突變酶的熱穩(wěn)定性和抗血紅素反饋抑制能力，且沒(méi)有用于ALA的生物合成。

此外，作為ALA合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，ALA合成酶活性、熱穩(wěn)定性和解除血紅素反饋抑制等性質(zhì)的提高可以加快工程菌ALA合成的催化效率，減少自身蛋白合成和降解過(guò)程中能量的損耗，進(jìn)而提升工程菌的穩(wěn)定性和生產(chǎn)性能，降低ALA生產(chǎn)成本，對(duì)促進(jìn)ALA在農(nóng)牧等領(lǐng)域的應(yīng)用有重要的價(jià)值。