[發(fā)明專利]一種采用熒光定量PCR技術(shù)定量檢測土壤中大腸桿菌O157:H7的方法

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• 申請日: 2021-03-18
• 公開（公告）號: CN112980976A
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 彭雙;王一明;宋丹;周貝貝;魏翠蘭
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇開放大學(xué)（江蘇城市職業(yè)學(xué)院）
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/10;C12R1/19
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 曹翠珍

本發(fā)明提供一種采用熒光定量PCR技術(shù)定量檢測土壤中大腸桿菌O157:H7的方法，該方法包括(1)提取樣本的微生物基因組DNA；(2)將所述基因組DNA放入PCR反應(yīng)管中，并向管中加入正向引物、反向引物、SYBR Green Reaction Mix、ROX和無菌水，對標(biāo)準(zhǔn)對照液和未知樣品同時進行PCR擴增和熔解曲線測定，獲得大腸桿菌O157:H7實時定量PCR的Ct值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)對照液的Ct值和拷貝數(shù)擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可定量檢測未知樣品中的大腸桿菌O157:H7，特異性高，準(zhǔn)確度強，最低檢測DNA濃度為1.5×10^?4ng/μL，可有效解決土壤和糞便中大腸桿菌O157:H7定量檢測的問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及土壤微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種大腸桿菌O157:H7定量檢測引物組，含有該引物組的試劑盒及其應(yīng)用，尤其涉及一種采用實時熒光定量PCR技術(shù)定量檢測土壤和糞便中大腸桿菌O157:H7的引物和方法。

背景技術(shù)

大腸桿菌O157(Escherichia coli O157)是與食源性爆發(fā)相關(guān)的最常見的病原菌之一。植物生長的土壤是病原菌潛在的污染來源，糞便中存活的腸道病原菌在它們進入土壤環(huán)境后可進一步污染作物和河道，從而增加胃腸道疾病的潛在傳播風(fēng)險。大腸桿菌O157能夠在施用糞肥的土壤中長期生存。據(jù)報道，大腸桿菌O157:H7在21℃條件下可在土壤中存活200天以上，最高可存活長達(dá)600天。即使是在含水量較低的土壤中，腸出血型大腸桿菌也能存活數(shù)月之久。一些大腸桿菌可以在河岸土壤以及河流底泥中生長，大腸桿菌O157:H7甚至可以吸收利用土壤中的可溶性物質(zhì)。病原菌污染作物的潛力，與其在環(huán)境中的存活能力有直接的關(guān)系，如果病原菌能夠存活至作物收獲期，則可能通過被污染的作物傳播到消費者體內(nèi)。因此，應(yīng)對糞便中殘留病原菌在土壤中的存活時間和濃度、及其向地表和地下水資源遷移的風(fēng)險給予充分的關(guān)注。

大腸桿菌O157:H7的檢測方法有很多，但是這些方法大部分并不適用于微生物多樣性非常高的土壤樣品和糞便樣品，而且檢測時間也較長，定量檢測難度較大。因此建立適用于土壤和糞便樣品的，快速且靈敏的大腸桿菌O157:H7的定量檢測方法十分重要，對畜禽糞肥在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的合理施用，農(nóng)業(yè)系統(tǒng)大腸桿菌O157:H7污染的預(yù)防及控制均具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中大腸桿菌O157:H7的檢測效果欠佳的缺陷，從而提供一種采用熒光定量PCR技術(shù)定量檢測土壤中大腸桿菌O157:H7的方法，該方法準(zhǔn)確度高，特異性強，便于推廣。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種用于熒光定量PCR技術(shù)定量檢測大腸桿菌O157:H7的方法，其包括以下步驟，(1)提取樣本的微生物基因組DNA；(2)將所述基因組DNA放入PCR反應(yīng)管中，并向管中加入正向引物、反向引物、SYBR Green ReactionMix、ROX和無菌水，對標(biāo)準(zhǔn)對照液和未知樣品同時進行PCR擴增和熔解曲線測定，獲得大腸桿菌O157:H7實時定量PCR的Ct值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)對照液的Ct值和拷貝數(shù)擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可定量檢測未知樣品中的大腸桿菌O157:H7，其中，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示。

優(yōu)選的，所述正向引物和所述反向引物的用量比為1:1。

優(yōu)選的，所述進行PCR擴增，其反應(yīng)條件為，預(yù)變性：95℃3min；變性：95℃20秒；退火：52-59℃30秒；延伸：72℃30秒，采集熒光信號；重復(fù)變性至延伸的步驟，總共40個循環(huán)。

優(yōu)選的，所述熔解曲線測定，其為在所述延伸步驟后進行，測定條件為65℃升溫至95℃，每隔0.5℃收集熒光信號。

優(yōu)選的，最低檢測DNA濃度為1.5×10^-4ng/μL。

優(yōu)選的，土壤中最低檢測拷貝數(shù)為19.5copies/μl DNA，2.99copies/ng DNA，8.1×10³copies/g土壤。