[發明專利]一種采用熒光定量PCR技術定量檢測土壤中大腸桿菌O157:H7的方法

在審

• 申請號: 202110292532.7
• 申請日: 2021-03-18
• 公開（公告）號: CN112980976A
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發明（設計）人: 彭雙;王一明;宋丹;周貝貝;魏翠蘭
• 申請（專利權）人: 江蘇開放大學（江蘇城市職業學院）
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/10;C12R1/19
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 曹翠珍

1.一種采用熒光定量PCR技術定量檢測大腸桿菌O157:H7的方法，其特征在于：包括以下步驟，

(1)提取樣本的微生物基因組DNA；

(2)將所述基因組DNA放入PCR反應管中，并向管中加入正向引物、反向引物、SYBRGreen Reaction Mix、ROX和無菌水，對標準對照液和待測樣品同時進行PCR擴增和熔解曲線測定，獲得大腸桿菌O157:H7實時定量PCR的Ct值，根據標準對照液的Ct值和拷貝數擬合的標準曲線，即可定量檢測未知樣品中的大腸桿菌O157:H7，其中，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如權利要求1所述的采用熒光定量PCR技術定量檢測大腸桿菌O157:H7的方法，其特征在于：所述正向引物和所述反向引物的用量比為1:1。

3.如權利要求1所述的采用熒光定量PCR技術定量檢測大腸桿菌O157:H7的方法，其特征在于：所述進行PCR擴增，其反應條件為，

預變性：95℃3min；

變性：95℃20秒；

退火：52-59℃30秒；

延伸：72℃30秒，采集熒光信號；

重復變性至延伸的步驟，總共40個循環。

4.如權利要求1所述的采用熒光定量PCR技術定量檢測大腸桿菌O157:H7的方法，其特征在于：所述熔解曲線測定，其為在所述延伸步驟后進行，測定條件為65℃升溫至95℃，每隔0.5℃收集熒光信號。

5.如權利要求1所述的采用熒光定量PCR技術定量檢測大腸桿菌O157:H7的方法，其特征在于：最低檢測DNA濃度為1.5×10^-4ng/μL。

6.如權利要求1所述的采用熒光定量PCR技術定量檢測大腸桿菌O157:H7的方法，其特征在于：土壤中最低檢測拷貝數為19.5copies/μl DNA，2.99copies/ng DNA，8.1×10³copies/g土壤。

7.如權利要求1所述的采用熒光定量PCR技術定量檢測大腸桿菌O157:H7的方法，其特征在于：步驟(2)中，獲得標準對照液中的大腸桿菌O157:H7實時定量PCR的Ct值后，以拷貝數的對數為橫坐標、Ct值為縱坐標，擬合標準曲線，將未知樣品的Ct值帶入標準曲線公式，即可獲得待測樣品的大腸桿菌O157:H7定量數據。