[發明專利]一種整合高拷貝人源溶菌酶基因的重組畢赤酵母工程菌及構建方法

在審

• 申請號: 202110292418.4
• 申請日: 2021-03-18
• 公開（公告）號: CN113637598A
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發明（設計）人: 喻恒鋒;喻致遠;曹立環;周正;龔文偉
• 申請（專利權）人: 上海復華興生物技術有限公司;義烏市歐雅化妝品有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/90;C12N15/67;C12N15/64;C12N15/56;C12R1/84
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

本發明提供了一種整合高拷貝人源溶菌酶基因的重組畢赤酵母工程菌及構建方法，所述重組畢赤酵母工程菌命名為FHX?LYC71；其保藏機構為：中國典型培養物保藏中心，保藏號：CCTCC M 2021181。所述畢赤酵母工程菌是將人源溶菌酶基因的人工合成序列以BamH I和EcoR I位點裝載于pPIC9K載體上，再高拷貝整合于畢赤酵母基因組，能高表達人源溶菌酶蛋白。

技術領域

本發明涉及一種含高拷貝人源溶菌酶基因的高表達重組畢赤酵母工程菌及構 建方法，該重組畢赤酵母工程菌同時具有高拷貝高表達的特征。

技術背景

溶菌酶首次于1922年被英國的細菌學家佛萊明發現，直到1937年，Abraham 與Robinson從卵蛋白中分離出溶菌酶晶體，人們才開始對溶菌酶進行研究。1965 年，Blake等人用x射線晶體結構分析法闡明了雞蛋白溶菌酶的三維結構,證實 了溶菌酶含有4對二硫鍵，其分子近橢圓形。研究還發現溶菌酶的內部幾乎全部 為非極性，疏水的相互作用在溶菌酶的折疊構象中起到重要作用，并發現在溶菌 酶分子的表面有一個裂縫，該裂縫的大小恰好能容納多糖底物的6個單糖，即為 溶菌酶的活性部位。2001年，Vavid等人證實了NAM和NAG之間的β-1，4-糖苷 鍵的水解是通過一個雙置換反應完成的。溶菌酶能水解肽聚糖中的N一乙酰葡萄 糖和N一乙酰胞壁酸之間的β-1，4糖苷鍵，以此破壞細菌的細胞壁，具有較強的抑菌抗菌活性。溶菌酶在自然界中來源廣泛，可分為微生物、噬菌體、植物和 動物四種類型的溶菌酶，其中動物溶菌酶活性高，應用廣泛。在人體內，溶菌酶 分布相當廣泛，主要存在于體液、細胞和組織器官中。報道的主要有眼淚、唾液、 鼻涕、汗液、尿液、血清、胸水、淋巴液、腦脊液體液中，白細胞、巨噬細胞、 單核細胞中，組織器官有心、肺、肝、脾、腎、胎盤，其中在腎和肺中含量最高。

1992年FAO/WTO的食品添加劑協會公布：溶菌酶應用于食品工業中是安全的， 我國衛生部2010年第23號公告批準溶菌酶等物質為食品添加劑。溶菌酶的化學 本質為蛋白質，在人及動物的胃腸內可以被消化、吸收。因此不會在體內殘留， 無毒性，安全性很高，在藥品、飼料和食品等行業具有廣泛的應用前景。在食品 工業中可應用于水產品、乳制品、果蔬、肉類、酒及飲料的防腐保鮮。在畜牧業 溶菌酶可用作飼料防腐劑和殺菌劑。在醫學上溶菌酶可以代替抗生素作為抗菌消 炎的藥物。

如今抗生素耐藥問題日趨嚴重，尋找抗生素物質的補充或可替代產品刻不容 緩，臨床上由于抗生素藥物的長期使用，致使很多致病菌產生了廣泛的耐藥性。 因此科研工作人員對原始的抗生素物質進行了各種修飾，得到了很多抗生素藥物 的衍生物，然而盡管如此，仍難以彌補抗生素及其衍生物的缺陷。并且作為一種 人體外源藥物，某些人群會對抗生素產生過敏反應，而人溶菌酶作為人體自身存 在的一種蛋白，可以很好地彌補這一缺陷。人溶菌酶是一種通過水解細菌細胞壁 中肽聚糖而發生溶菌的胞壁質酶。除了溶菌酶的殺菌，控腫、消炎的作用，溶菌 酶在人體內部環境中還具有改善局部血液循環、組織修復和分解膿液等功效。因 此人溶菌酶藥物的應用可直接減少抗生素物質等的使用，具有廣闊的市場前景和 重要的商業價值。目前市場上的溶菌酶產品大多以蛋清溶菌酶為主要原料，我國 SFDA已下達13個雞溶菌酶腸溶片生產文號、16個含片生產文號。除了應用在醫 藥行業，雞溶菌酶在日化行業也得到了應用，如口腔護理產品牙膏、漱口液、噴 劑，化妝品等。目前，溶菌酶主要從雞蛋清和蛋殼膜中提取。但這種直接提取的 生產方式，其規模小、成本高，不利于大規模化生產與應用。同時，雞蛋清溶菌 酶對于人體而言是一種異源蛋白，在蛋白質一級結構上與人溶菌酶有較大差異， 因此，它具有明顯的局限性。雞溶菌酶用于過敏體質人群時，可引發過敏反應， 嚴重者可導致死亡。另外，雞溶菌酶在人體內會產生免疫原性與毒副作用，無法 用于靜脈用藥。由于雞溶菌酶的局限性，人們開始更加關注人溶菌酶的研究和開 發。