[發明專利]一種整合高拷貝人源溶菌酶基因的重組畢赤酵母工程菌及構建方法

在審

• 申請號: 202110292418.4
• 申請日: 2021-03-18
• 公開（公告）號: CN113637598A
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發明（設計）人: 喻恒鋒;喻致遠;曹立環;周正;龔文偉
• 申請（專利權）人: 上海復華興生物技術有限公司;義烏市歐雅化妝品有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/90;C12N15/67;C12N15/64;C12N15/56;C12R1/84
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

1.一種整合高拷貝人源溶菌酶基因的重組畢赤酵母工程菌，命名為FHX-LYC71；

其保藏機構為：中國典型培養物保藏中心，保藏號：CCTCC M 2021181。

2.一種整合高拷貝人源溶菌酶基因的重組畢赤酵母工程菌，其特征在于所述重組畢赤酵母工程菌是將SEQ ID NO.1所示人工合成序列中所涉及特有的編碼人源溶菌酶基因序列裝載于pPIC9K載體，而不是pPIC9載體。

3.如權利要求1或2所述的重組畢赤酵母工程菌，其特征在于所述畢赤酵母為畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115。

4.如權利要求2所述的重組畢赤酵母工程菌，其特征在于SEQ ID NO.1序列中以BamH I和EcoR I位點裝載于pPIC9K載體上，再整合于畢赤酵母基因組。

5.如權利要求1或2所述的重組畢赤酵母工程菌，其特征在于該重組畢赤酵母工程菌能在4.0mg/mL遺傳霉素(G418)的YPD平板上生長。

6.如權利要求1或2所述的重組畢赤酵母工程菌，其特征在于經定量PCR分析表明該重組畢赤酵母工程菌人溶菌酶基因的拷貝數在該重組畢赤酵母工程菌為大于等于8。

7.如權利要求1或2所述的重組畢赤酵母工程菌，其特征在于所述重組畢赤酵母工程菌的構建方法包括以下步驟：

1)將SEQ ID NO.1所示人工合成序列以BamH I和EcoR I位點裝載于分泌型表達質粒pPIC9K上，獲得重組質粒pPIC9K-LYC71；

2)將重組質粒pPIC9K-LYC71用Sal I單酶切，在His4位點進行線性化,然化將上述線性化質粒電轉化畢赤酵母GS115感受態細胞，再將轉化的畢赤酵母GS115感受態細胞涂布于MD平板，培養后，挑取MD平板上的His+轉化子500個,然后經在MD和MM平板篩選，挑選MD和MM平板均生長均良好的克隆即Mut+表型200個；

3)將200個Mut+表型轉化子接種于在濃度為2.0，3.0,4.0mg/mL遺傳霉素G418的YPD平板上，篩選多拷貝轉化子；

4)上面篩選得到多拷貝轉化子，先經PCR驗證，然后經定量PCR分析，挑選在4.0mg/mL遺傳霉素G418的YPD平板上生長，經定量PCR分析驗證人溶菌酶基因的拷貝數在該重組畢赤酵母工程菌為大于等于8的20個轉化子；

5)將步驟4)挑選的轉化子進行小量表達溶菌酶試驗，然后挑選其中高表達的5株，進行搖瓶誘導表達實驗，

6)將上面挑選的5株高表達工程菌搖瓶誘導表達實驗，5株高表達工程菌分別接種到YPD平板上，分別進行搖瓶甲醇誘導表達實驗，72小時后結束培養，將發酵液經12000rpm離心1min，收集上清液，于-20℃保存，分析目的蛋白的表達量和酶活性；最后挑選其中高表達的2株，保存，用于下面的發酵罐發酵檢驗

7)發酵罐發酵檢驗，具體如下，將上面2株重組畢赤酵母工程菌分別接種到YPD平板上28℃培養45h；挑取平板單菌落接種到500ml YPD培養基中，28℃，210r/min培養24小時，當OD600＝3～5時，可準備接種于發酵罐；得到種子培養液；

然后以5％的接種量將所述種子培養液接種于含7.5L培養基的15L自動控制發酵罐中，培養溫度為28℃，攪拌轉速為230rpm/min，自動流加氨水控制pH值為5.8-6.1，通氣量為3L/min/L，生長階段溫度為28℃，設置溶氧DO-轉速聯動；通過調節攪拌轉速和通氣量以維持溶氧在20-30％左右；當發酵罐中的甘油耗盡后，可觀察到DO值上升，表明甘油已經耗盡；此時開始流加50％甘油溶液；當菌體達到一定濃度后，停止補料；停止補加甘油后，菌體維持饑餓狀態45分鐘，待甘油徹底耗盡，開始甲醇誘導；開始以變速流加的方式限制性的流加補料誘導培養基，誘導人源溶菌表達；誘導階段溫度為25℃，pH5.5-6.0；控制甲醇補料培養的補料速率為2.8-3.4mL/h/L起始發酵培養基，維持溶解氧DO大于10％，誘導后78小時結束發酵；

在上面的2株中，最后挑選一株表達量最高的工程菌命名為FHX-LYC71，發酵液溶菌酶活性達到56000單位每毫升以上；產量可達到每升發酵液2.8克人源溶菌酶蛋白；

8)將FHX-LYC71工程菌進行保藏。

8.一種整合高拷貝人源溶菌酶基因的重組畢赤酵母工程菌構建方法，其特征在于所述畢赤酵母工程菌是將人源溶菌酶基因的人工合成序列以BamH I和EcoR I位點裝載于pPIC9K載體上，再高拷貝整合于畢赤酵母基因組，能高表達人源溶菌酶蛋白，將此工程菌命名為FHX-LYC71，其保藏機構為：中國典型培養物保藏中心，保藏號：CCTCC M 2021181。