[發(fā)明專利]用于高效誘導(dǎo)擴(kuò)增人體外周血殺傷性免疫細(xì)胞的組合物、試劑盒以及該免疫細(xì)胞的培養(yǎng)方法

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• 申請日: 2021-03-18
• 公開（公告）號: CN113046313A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李偉強;邵文陶
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶福美干細(xì)胞生物科技發(fā)展有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/0784
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務(wù)所(普通合伙) 50211
• 代理人: 郭麗;郭云

1.一種用于高效誘導(dǎo)擴(kuò)增人體外周血殺傷性免疫細(xì)胞的組合物，其特征在于，所述組合物包括白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、前列腺素E2(PGE2)、干擾素γ(INF-γ)、CD3單抗、CD28單抗、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子(GM-CSF)、白細(xì)胞介素-1α(IL-1α)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)以及PD-1抗體或者CTLA-4抗體。

2.一種用于高效誘導(dǎo)擴(kuò)增人體外周血殺傷性免疫細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括以下組分：第一誘導(dǎo)因子組、第二誘導(dǎo)因子組、第三誘導(dǎo)因子組、激活培養(yǎng)基和誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述第一誘導(dǎo)因子組包括以下組分：500-1000U/ml IFN-γ、200-600ng/ml CD3、200-600ng/ml CD28、2000-7000U/ml IL-2和2-5ng/ml IL-1α；所述第二誘導(dǎo)因子組包括以下組分：400-1000U/ml GM-CSF、500-1200U/ml IL-4、1-3mM Gln、600-1000U/ml TNF-α、5-20ng/ml IL-1β、500-1200U/ml IL-6、1-4ug/ml PGE2；所述第三誘導(dǎo)因子組包括以下組分：1000U/ml IL-2和9-12mg PD-1抗體或CTLA-4抗體。

3.如權(quán)利要求2所述的一種用于高效誘導(dǎo)擴(kuò)增人體外周血殺傷性免疫細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，所述激活培養(yǎng)基包括VIVO15培養(yǎng)基；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括配比為2:1的VIVO15培養(yǎng)基和TAKARA551培養(yǎng)基。

4.一種人體外周血殺傷性免疫細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1，采集人體外周血，分離外周血和自體血漿，從提取血漿后的外周血中分離單個核細(xì)胞；

S2，培養(yǎng)T細(xì)胞：

S21，將分離得到的外周血單個核細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，以使部分單個核細(xì)胞貼壁；

S22，收集培養(yǎng)箱內(nèi)的懸浮細(xì)胞，用激活培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1～2*10⁶/ml，加入試劑500-1000U/ml的IFN-γ和10％濃度的自體血漿；

S23，培養(yǎng)24h后，加入200-600ng/ml的CD3單抗、200-600ng/ml的CD28單抗、2000-70000U/ml的IL-2和2-5ng/ml的IL-1α；

S24，培養(yǎng)96h后，補充FETURE O培養(yǎng)基，并補加含重組人IL-2500-1000U/ml的激活培養(yǎng)基250ml；

S25，再培養(yǎng)72h后，收獲T細(xì)胞；

S3，培養(yǎng)DC細(xì)胞：

S31，將400-1000U/ml的GM-CSF、500-1200U/ml的IL-4、1-3mM Gln和1.5％-3.0％人血白蛋白加入50ml培養(yǎng)基激活培養(yǎng)基中，得到混合培養(yǎng)基，向步驟S21培養(yǎng)箱的貼壁細(xì)胞中加入15ml所述混合培養(yǎng)基和1-5％的自體血漿；

S32、48h后，再次加入5ml所述混合培養(yǎng)基；

S33、再經(jīng)過48h后，再次加入5ml所述混合培養(yǎng)基；

S34、再次培養(yǎng)48h后，從培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基抽出25ml混合液，離心后，移除12.5ml上清并加入12.5ml的所述混合培養(yǎng)基，再加入600-1000U/ml的TNF-α、5-20ng/ml的IL-1β、500-1200U/ml的IL-6和1-4ug/ml的PGE2；

S35、培養(yǎng)24h后，收獲DC細(xì)胞；

S4，培養(yǎng)殺傷性免疫細(xì)胞：

S41，將上述獲得的T細(xì)胞與DC細(xì)胞共培養(yǎng)，添加含1000U/ml重組人IL-2的誘導(dǎo)培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基；

S42，每間隔72h補液一次，并同時補加1000U/ml重組人IL-2；

S43，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到1*10¹⁰以上時，收集細(xì)胞；

S44，向步驟S43收集的細(xì)胞中加入9-12mg PD-1抗體或者CTLA-4抗體，并在培養(yǎng)箱中孵育30min，獲得所述殺傷性免疫細(xì)胞。

5.如權(quán)利要求4所述的一種人體外周血殺傷性免疫細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟S1采集的人體外周血單個核細(xì)胞來源于腫瘤患者的外周血。