[發(fā)明專利]一種純化豬輪狀病毒的方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110291568.3
• 申請(qǐng)日: 2021-03-18
• 公開（公告）號(hào): CN113073087A
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周明光;張華偉;周飛燕;徐高原;羅修鑫;陳映瑾;余蕾;湯細(xì)彪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢科前生物股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N7/02
• 分類號(hào): C12N7/02
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 錢云

本發(fā)明涉及獸用疫苗技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種純化豬輪狀病毒的方法及其應(yīng)用。所述方法包括：取片狀載體培養(yǎng)的豬輪狀病毒液作為待純化病毒液；對(duì)所述待純化病毒液進(jìn)行膜包濃縮和離子交換層析：首先使用100～300KD膜包將病毒液濃縮，經(jīng)過(guò)3次洗濾，將病毒液濃縮20倍后再利用離子交換層析技術(shù)將病毒捕獲洗脫，達(dá)到精細(xì)分離純化的目的。本發(fā)明通過(guò)特定的膜包濃縮技術(shù)結(jié)合離子交換層析，較大程度地增加了病毒的回收率，降低了雜蛋白的含量，提高了豬輪狀病毒的濃度，可以應(yīng)用至豬輪狀病毒疫苗中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及疫苗技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種純化豬輪狀病毒的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

豬輪狀病毒病是由輪狀病毒感染引起的仔豬腹瀉性疾病。主要癥狀為厭食、嘔吐、下痢，中豬和大豬為隱性感染。病原體除豬輪狀病毒外，人、雞、牛、馬等的幼齡動(dòng)物分離的輪狀病毒也可感染仔豬，引起不同程度的癥狀。輪狀病毒對(duì)外界環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，在18～20攝氏度的糞便和乳汁中，能存活7～9個(gè)月。

目前，豬輪狀病毒廣泛分布于各地養(yǎng)豬場(chǎng)，其高病死率給各地的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。但是針對(duì)豬的輪狀病毒尚無(wú)特效藥治療，控制輪狀病毒感染最有效的方法是接種疫苗，但是用于制備疫苗的原料病毒，通常在細(xì)胞中培養(yǎng)，收獲的培養(yǎng)液除含有病毒外，還含有宿主蛋白核酸及培養(yǎng)過(guò)程中引入雜質(zhì)，如果雜質(zhì)含量過(guò)多，可能會(huì)對(duì)疫苗安全性及有效性產(chǎn)生不利影響。

膜包濃縮技術(shù)是一種改革傳統(tǒng)工藝實(shí)現(xiàn)高效純化濃縮的技術(shù)。具體原理為料液以一定的流速在膜的上表面循環(huán)，小于膜孔徑的物質(zhì)可以透過(guò)膜到透過(guò)端，而大于膜孔徑的物質(zhì)會(huì)被膜截留，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的濃縮以及不同物質(zhì)的分級(jí)分離。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種純化豬輪狀病毒的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)特定的膜包濃縮技術(shù)結(jié)合離子交換層析，較大程度地增加了病毒的回收率，降低了雜蛋白的含量，提高了目標(biāo)產(chǎn)物的濃度。

第一方面，本發(fā)明提供一種純化豬輪狀病毒的方法，包括：

取片狀載體培養(yǎng)的豬輪狀病毒液作為待純化病毒液；

對(duì)所述待純化病毒液進(jìn)行膜包濃縮和離子交換層析；

所述膜包濃縮包括如下流程：

使用100～300KD膜包將所述待純化病毒液濃縮至起始體積的1/5～1/10，后補(bǔ)加緩沖液并濃縮至所述起始體積的1/10～1/20，再次補(bǔ)加緩沖液濃縮至所述起始體積的1/20～1/40。

進(jìn)一步地，所述100～300KD膜包在使用前經(jīng)過(guò)如下預(yù)處理流程：

使用堿溶液對(duì)所述100～300KD膜包進(jìn)行循環(huán)滅菌處理，再通過(guò)無(wú)菌注射水清洗所述100～300KD膜包至pH為6.8～7.2。

進(jìn)一步地，在所述膜包濃縮后，使用所述起始體積1/20～1/40的緩沖液沖洗膜包，收集洗膜液。

進(jìn)一步地，所述緩沖液為0.01～0.02mol/L的PB溶液。

進(jìn)一步地，所述離子交換層析的介質(zhì)為Q Focurose 6FF。

進(jìn)一步地，所述離子交換層析的洗脫液包括含0.2～0.3mol/L的NaCl的PBS，所述PBS的濃度為0.01～0.02mol/L。

進(jìn)一步地，所述離子交換層析過(guò)程中，pH保持在8.0～8.1，和/或，病毒濃縮液上樣的線性流速為50～60cm/h，和/或，壓力小于2.5bar。

本發(fā)明進(jìn)一步提供所述方法在制備用于免疫豬輪狀病毒的藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述藥物為疫苗。

本發(fā)明具備如下有益效果：