[發(fā)明專利]一種新型冠狀病毒檢測方法

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• 申請日: 2021-03-18
• 公開（公告）號: CN113030469A
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發(fā)明（設計）人: 王文智;路瑤;黃煒;劉昆
• 申請（專利權）人: 貴州省分析測試研究院;杭州晶佰生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 貴陽貴知知識產權代理事務所(普通合伙) 52115
• 代理人: 曾香蘭;蔣琳琳

本發(fā)明涉及一種新型冠狀病毒檢測方法，所述檢測方法包括抗體儲備緩沖液的置換；磁珠的準備；抗體標記生物素biotin；標準品的配置；上機分析；該檢測方法具有能在短時間內檢測極低豐度值病毒特征性蛋白的優(yōu)點，一小時內可分析96個樣本(若采用全自動HD?1機型通量可達288個)，同時樣本上機分析均在封閉儀器中自動進行加樣和處理，大大降低了試驗人員與檢測樣本接觸導致的感染風險。且該方法不僅能定性檢測，更能精確定量檢測，能夠最大程度的提高新型冠狀病毒感染的檢測靈敏度，也能保證檢測結果的可信度。

技術領域

本發(fā)明屬于分子生物學檢測技術領域，尤其涉及一種新型冠狀病毒檢測方法。

背景技術

自2019年11月新型冠狀肺炎(以下簡稱“新冠”)病毒被發(fā)現并被證實以來，給全球造成的疫情影響已不容樂觀。邁入2021年，累計確診該病病例已破億數，檢測防控形勢仍是對全球疫情防控事業(yè)一個巨大的考驗。目前作為最重要檢測指標的核酸檢測假陰性率過高，且存在一定數量的無癥狀患者(病毒的攜帶者)，漏檢情況頻發(fā)，導致了病毒的擴散和疫情的發(fā)展。因此，建立新的檢測技術對降低檢測的假陰性率意義重大。同時，在研發(fā)針對性的新冠病毒疫苗的同時，開發(fā)更高靈敏度的病毒檢測技術，能更早更快的確定病毒感染攜帶風險，從而切斷人群流動的傳播途徑，達到確切的預防和篩查新冠肺炎攜帶防控效力。

目前，通常采用熒光定量PCR檢測法檢測新冠病毒假陰性率達到40％，一方面是因為檢材取樣標準化不夠，例如病毒還未擴散至下呼吸道時，而采用取口腔拭子的取樣方法，會降低檢測結果的不準確度，且取鼻拭子會伴有取樣疼痛或不舒適感也會導致受試者排斥；另一方面，由于隨著核酸提取和PCR的靶標片段損失，檢出限也會隨之降低。而目前基于抗體的檢測方法(例如膠體金法)只能定性、不能定量，感染者可能由于免疫系統不活躍或耐受性的原因，沒有產生足夠的抗體，導致假陰性；而膠體金本身存在一定的假陽性率。

傳統的ELISA反應中，抗原-抗體的反應體系通常在100μl，大量的熒光信號產生后被稀釋在100μl的反應環(huán)境中，所以目前最大的問題是檢測靈敏度不高，最高通常在皮克級別 (pg/ml)。

針對以上問題，發(fā)明人把目標放到檢測新冠病毒的抗原，即新冠病毒本身上，增強檢測方法的特異性和靈敏度。參照現有單分子免疫陣列(Single Molecule Arrays，SiMoA)技術平臺進行開發(fā)，該方法操作較為簡單，有極強的開放性和靈活性，僅需要能夠特異性識別某種抗原的抗體對和待測抗原標準品并配置標準曲線，就能夠檢測樣本里面的待測抗原，樣本可以是血清、血漿、腦脊液、尿液、唾液和細胞裂解液等。該技術使用和傳統ELISA的原理，形成雙抗夾心的免疫復合物，保證了反應的特異性。操作時需按照一定的包被條件將抗體對的其中一個包被到直徑2.7μm磁珠的抗體結合位點上，另一個用生物素標記后加入進行孵育，孵育結束后加入親和素偶聯的酶和酶反應的底物，形成加入反應芯片的免疫復合物。每個芯片有238000個小孔，每個小孔的直徑為4.2μm，剛好僅能落入一個磁珠，基于重力的作用磁珠掉入小孔后，系統會在芯片表面推一層油，一方面將多余的磁珠去除，最主要的還是將熒光信號鎖住在小孔中(不易發(fā)生信號擴散和交叉反應)。這種情況下，酶分子催化底物產生的熒光分子就被鎖在小孔反應體系中，含有目標抗原的磁珠因為帶有酶而發(fā)出熒光，含有熒光的磁珠數目與落入整個芯片表面所有磁珠數目的比例與樣本中目的抗原的濃度呈正相關，計算機便可準確計算出待測樣品中目標抗原的濃度。

發(fā)明內容

本發(fā)明提供一種新型冠狀病毒檢測方法，所述檢測方法包括以下步驟：(1)抗體儲備緩沖液置換為磁珠連接緩沖液；(2)磁珠的準備；(3)抗體標記生物素biotin；(4)標準品的配置；(5)上機分析。

所述(1)抗體儲備緩沖液置換為磁珠連接緩沖液步驟為：

1)用超微量分光光度計分別測定MM05抗體和R001抗體的濃度，根據包被抗體要求的量100μg及測得的抗體濃度計算每個抗體需要的體積；