[發(fā)明專利]一種適于芽孢桿菌的高質(zhì)量總RNA提取的方法

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• 申請日: 2021-03-18
• 公開（公告）號: CN112899269A
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李舒;番華彩;鄭泗軍;何平;徐勝濤;白亭亭;劉立娜;曾莉;李迅東;尹可鎖;尚慧;郭志祥
• 申請（專利權(quán)）人: 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京挺立專利事務(wù)所(普通合伙) 11265
• 代理人: 石磊

本發(fā)明公開了一種適于芽孢桿菌的高質(zhì)量總RNA提取的方法，包括如下步驟：(1)菌體培養(yǎng)與收集；(2)反復(fù)洗滌菌體；(3)溶菌酶處理芽孢桿箘細胞壁；(4)液氮速凍；(5)加入RNAiso Plus震蕩后放入水浴鍋中加熱；(6)氯仿提純兩次，并采用異丙醇沉淀；(7)采用DEPC乙醇清洗沉淀后再用無水乙醇清洗。(8)采用核酸密度檢測儀和瓊脂糖凝膠檢測所提RNA的濃度和質(zhì)量。本發(fā)明有效的方法解決了常規(guī)提取方法提取芽孢桿箘存在的RNAA260/A280以及A260/A230比值偏低及無機鹽污染的情況。同時很大程度上去除了rRNA和tRNA，完整的保留了mRNA，更有利于后續(xù)實驗的進行。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適于芽孢桿菌的高質(zhì)量總RNA提取的方法。

背景技術(shù)

細菌RNA的提取相對于真核生物來說，難度更大。芽孢桿箘屬于革蘭氏陽性菌，相對于革蘭氏陰性菌，其細胞壁厚(約20-80nm,革蘭氏陰性菌約8-20nm)層數(shù)多(約15-50層，革蘭氏陰性菌約1-3層)，細胞壁中的肽聚糖含量高(占細胞干重的50％-80％，革蘭氏陰性菌為10％-20％)，且交聯(lián)更為致密(1)。相對于RNA提取，有效的細胞裂解是獲得高質(zhì)量及高產(chǎn)量RNA必要且至關(guān)重要的前提條件。目前，常用的細菌細胞壁破碎法有超聲波法、酶解法、液氮研磨法等等(2，3)，但這些常規(guī)的這些方法很難有效的破碎芽孢桿箘的細胞壁。除此之外，細胞壁破碎后，芽孢桿箘的內(nèi)含物很容易與RNA結(jié)合，形成多糖多和酚類難溶的物質(zhì)，導(dǎo)致RNA分離困難(4，5)。

芽孢桿菌屬內(nèi)多數(shù)種都具有強大的蛋白質(zhì)外泌系統(tǒng)，能向胞外分泌多種酶，分泌的酶量大、種類多，其中就包括了RNA酶，而其產(chǎn)生的內(nèi)源性RNA酶也加大了RNA提取的難度(6)。相對真核細胞來說，細菌RNA的半衰期較短，5′沒有帽子結(jié)構(gòu)，3′沒Poly(A)尾巴，本身就很容易降解(7)，也加大了芽孢桿箘RNA提取的難度，因此常規(guī)的試劑盒無法提取高質(zhì)量的芽孢桿箘RNA。

一般從材料中提取出的RNA中，rRNA大約占80％，tRNA約占10％～15％，mRNA約占1％～5％。而對于許多后續(xù)的分子生物學(xué)實驗，rRNA和tRNA通常是沒有用處的(8)。因此，研究人員常采用一些方法如加熱法來去除總RNA中的rRNA和tRNA，以便更加有效地用于后續(xù)實驗(1)。

芽孢桿菌屬內(nèi)多數(shù)種都能向胞外分泌多種酶，尤其是胞外分泌的RNA酶很容易造成RNA降解。因此，針對該問題，采用2mL的0.1％DEPC滅菌水對收集的菌體進行反復(fù)清洗(不少于4次)，以去除芽孢桿箘分泌的胞外酶，降低后續(xù)提取過程中RNA的降解。

由于芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性菌，其細胞壁厚而致密，因此常規(guī)的提取方法不能有效裂解細胞壁使內(nèi)容物釋放，從而導(dǎo)致所提取的RNA出現(xiàn)濃度偏低的情況。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供了一種適于芽孢桿菌的高質(zhì)量總RNA提取的方法。

為了解決現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：本發(fā)明的一種適于芽孢桿菌的高質(zhì)量總RNA提取的方法，包括如下步驟：

(1)菌體培養(yǎng)與收集；

(2)反復(fù)洗滌菌體；

(3)溶菌酶處理芽孢桿箘細胞壁；

(4)液氮速凍；

(5)加入RNAiso Plus震蕩15min后放入100℃水浴鍋中加熱15-25min；

(6)氯仿提純兩次，并用異丙醇沉淀；

(7)采用75％的DEPC乙醇清洗沉淀2次后再用無水乙醇清洗2次。

(8)采用核酸密度檢測儀和1％的瓊脂糖凝膠檢測所提RNA的濃度和質(zhì)量。