[發明專利]一種適于芽孢桿菌的高質量總RNA提取的方法

在審

• 申請號: 202110289480.8
• 申請日: 2021-03-18
• 公開（公告）號: CN112899269A
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發明（設計）人: 李舒;番華彩;鄭泗軍;何平;徐勝濤;白亭亭;劉立娜;曾莉;李迅東;尹可鎖;尚慧;郭志祥
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院農業環境資源研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京挺立專利事務所(普通合伙) 11265
• 代理人: 石磊

1.一種適于芽孢桿菌的高質量總RNA提取的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)菌體培養與收集；

(2)反復洗滌菌體；

(3)溶菌酶處理芽孢桿箘細胞壁；

(4)液氮速凍；

(5)加入RNAiso Plus震蕩15min后放入100℃水浴鍋中加熱15-25min；

(6)氯仿提純兩次，并采用異丙醇沉淀；

(7)采用75％的DEPC乙醇清洗沉淀2次后再用無水乙醇清洗2次。

(8)采用核酸密度檢測儀和1％的瓊脂糖凝膠檢測所提RNA的濃度和質量。

2.根據權利要求1所述的適于芽孢桿菌的高質量總RNA提取的方法，其特征在于：在步驟(1)中，菌體培養與收集：液體培養：37℃，16h，至OD至1.0，取2-4ml菌液，于2ml RNA-free離心管中12000rpm^-1離心1min，去除上清，收集菌體；平板培養：30℃，7天至對照TR4長至滿板，5-7天，用槍頭挑取芽孢桿箘與TR4相鄰的菌落邊緣，至裝有0.1％DEPC滅菌水的2mlRNA-free離心管中，12000rpm^-1離心1min，去除上清，收集菌體相同生長時期單獨培養的芽孢桿箘作為對照。

3.根據權利要求1所述的適于芽孢桿菌的高質量總RNA提取的方法，其特征在于：在步驟(2)中，滅菌水必須是經過0.1％的DEPC(焦碳酸二乙酯)在120℃高溫高壓條件下處理30分鐘的；所述的0.1％DEPC滅菌水為2mL，0.1％DEPC滅菌水對收集的菌體進行反復清洗，清洗次數不少于4次；在步驟(2)中，反復洗滌菌體：向所收集的菌體加入2ml 0.1％DEPC水，12000rpm^-1離心1min，去除上清，收集菌體；將步驟(2)重復3次。

4.根據權利要求1所述的適于芽孢桿菌的高質量總RNA提取的方法，其特征在于：在步驟(3)中，溶菌酶處理芽孢桿箘細胞壁：向上述菌體加入1ml 0.1％DEPC水，重懸菌體，再加入40ul溶菌酶，至終濃度為4mg/ml，37℃搖床120rpm 3-4h，12000rpm^-1離心1min，收集菌體。在步驟(3)中，溶菌酶母液配置：取0.4g溶菌酶溶解于4ml 0.1％DEPC水至終濃度為100mg/ml，4℃保存。

5.根據權利要求1所述的適于芽孢桿菌的高質量總RNA提取的方法，其特征在于：在步驟(4)中，將步驟(3)中收集的菌體，置于液氮中，冷凍3min。

6.根據權利要求1所述的適于芽孢桿菌的高質量總RNA提取的方法，其特征在于：在步驟(5)中，加入1-1.5ml RNAiso Plus；震蕩15min，放入100℃水浴鍋中加熱15-25min，迅速冰浴。

7.根據權利要求1所述的適于芽孢桿菌的高質量總RNA提取的方法，其特征在于：在步驟(6)中，加入1/5RNAiso Plus體積的氯仿；震蕩5min，室溫靜置5min；12000rpm^-1離心15min，取上清至新的RNA-free離心管中，再次加入氯仿，重復步驟(6)。(在步驟(6)中，1mlRNAiso Plus加入氯仿200ul；1ml RNAiso Plus加入氯仿300ul)；加入與上清同體積的異丙醇，輕柔混勻后室溫靜置10min。4℃，12000rpm^-1離心15min，棄上清。

8.根據權利要求1所述的適于芽孢桿菌的高質量總RNA提取的方法，其特征在于：在步驟(7)中，加入1mL75％的DEPC乙醇，上下顛倒7次，7500rpm^-1離心5min，棄上清，重復2次；加入1mL無水乙醇，上下顛倒7次，7500rpm^-1離心5min，棄上清，重復2次。室溫干燥10min，50-100uLRNA-free水溶解。

9.根據權利要求1所述的適于芽孢桿菌的高質量總RNA提取的方法，其特征在于：在步驟(8)中，采用核酸密度檢測儀和1％的瓊脂糖凝膠檢測所提RNA的濃度和質量，一般評估RNA純度的標準為：A260/A280比值為2.00±0.10，A260/A230的比值在2.00和2.40之間。