[發明專利]一種香蕉采后果實eATP水平的檢測方法

有效

• 申請號: 202110288991.8
• 申請日: 2021-03-18
• 公開（公告）號: CN113030052B
• 公開（公告）日: 2022-10-21
• 發明（設計）人: 蔣躍明;單幼霞;連巧巧
• 申請（專利權）人: 中國科學院華南植物園
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N21/84
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學俊

本發明涉及一種香蕉采后果實eATP水平的高效檢測方法，包括：對香蕉綠熟果實的統一預處理；香蕉果皮圓片組織的標準化制作；ATP檢測工作液的準備；eATP標準曲線的測定和計算；萃取樣品中eATP的高效測定與計算。本發明以香蕉為實施例，通過制作香蕉果皮組織中圓片來萃取eATP，利用化學發光儀（Luminometer）檢測螢光素酶催化ATP所產生的RLU熒光值的原理，來檢測果蔬衰老和應激反應過程中的eATP水平，具有靈敏度高、操作簡單、重復性好、測定成本低等優點。

技術領域

本發明涉及植物生理學領域，具體涉及一種香蕉采后果實eATP水平的高效檢測方法。

背景技術

腺苷三磷酸 (ATP)是所有活細胞內生化反應和信號傳遞過程的能量通貨，同時可通過胞吞胞吐、通道蛋白等途徑排到細胞外成為細胞外ATP（eATP），發揮重要的信號分子作用，參與植物的生長發育過程，并且作為一種損傷相關模式分子(Damage associatedmolecular pattern，DAMP)，植物逆境脅迫過程中發揮重要作用（Choi等，2014；Jiang等，2007；Li等，2018） 。果實成熟是由內部和環境因素引發的一個活躍的過程，而細胞內的能量狀態（iATP）和細胞外的eATP變化是果實成熟和貯藏過程中的一個重要特征。大量實驗研究表明，確保足夠的細胞內ATP供應和適宜濃度的細eATP信號，延緩采后衰老，減輕脅迫損耗，并保持品質和延長貨架期（Aghdam等，2018）。外源ATP處理可以減弱許多園藝產品的采后脅迫的影響和延緩采后衰老，例如荔枝（Yi等，2010）、龍眼（Zhang等，2017）、康乃馨（Song等，2014）以及豆芽（Chen等，2018）。因此，如何維持采后果蔬細胞內足夠的iATP和適宜濃度的eATP是開發設計保鮮技術的重要依據。雖然關于如何測定植物組織細胞內的ATP已有大量方法報道，但是關于如何測定植物eATP的方法較少。

近年來，科學家們發明了非損傷微電極檢測法來實時檢測eATP水平，具體操作為制作精密的金屬電極外包裹了以ATP為底物的生物酶層（例如甘油激酶和磷酸甘油氧化酶、己糖激酶和葡萄糖氧化酶等氧化還原酶系統），通過借助于顯微鏡以及顯微操作系統，使電極充分接近待測細胞或組織，在ATP 存在時，電極表面發生氧化還原反應，產生電子轉移，將化學信號轉換成電信號，通過檢測電信號的變化而間接測定ATP的濃度（Compagnone andGuilbault，1997；Kueng等，2004；Llaudet等，2005），主要應用于測定了神經細胞、爪蟾胚胎等細胞中的eATP（王浩然 等，2017）。雖然在2015年，Vanegas等首次將該方法應用于植物細胞，測定了水蕨孢子光誘導下以及玉米根在觸碰以及損傷時釋放的ATP，但實驗操作體系不完善，存在操作復雜、重復性差、測定成本高等問題，并且此項技術目前在植物學研究領域內的應用非常有限，對于體積較大、形狀不規則的植物組織或器官，例如香蕉以及其它果實等組織則難以利用此項技術探究其生理活動規律。

事實上，一方面，由于香蕉是一種典型的呼吸躍變型水果，其品質的形成在很大程度上取決于采后后熟，而后熟過程中需經歷了一系列生理生化變化，包括顏色轉黃、軟化、淀粉降解和香氣形成（Liu等，2009），并且香蕉果實容易受到冷害等脅迫，與細胞內的能量水平密切有關（Li 等，2015；Liu等，2019；Wang等，2015）。因此，香蕉果實是研究eATP在果蔬衰老和應激反應中的生理作用的理想材料。另一方面，D-熒光素在ATP以及螢光素酶的催化作用下，被氧化發光，在化學發光儀（Luminometer）測定熒光RLU值，靈敏度高，具有操作簡單、測定成本低等優點。而且，至今還未見通過標準化制作香蕉果皮組織中圓片萃取eATP，基于化學發光儀（Luminometer）/螢光素酶方法測定eATP水平的的方法的相關報道和專利公布。

發明內容

本發明的目的在于提供一種香蕉采后果實eATP水平的高效檢測方法，以克服現有技術中存在的缺陷。

為實現上述目的，本發明的技術方案是：一種香蕉采后果實eATP水平的高效檢測方法，按照如下步驟實現：

步驟S1：對香蕉綠熟果實的統一預處理；