[發(fā)明專利]一種香蕉采后果實(shí)eATP水平的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110288991.8
• 申請日: 2021-03-18
• 公開（公告）號: CN113030052B
• 公開（公告）日: 2022-10-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔣躍明;單幼霞;連巧巧
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院華南植物園
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N21/84
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 饒文君;蔡學(xué)俊

1.一種香蕉采后果實(shí)eATP水平的高效檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟S1：對香蕉綠熟果實(shí)的統(tǒng)一預(yù)處理；

步驟S2：香蕉果皮圓片組織的標(biāo)準(zhǔn)化制作；

步驟S3：香蕉果皮組織eATP的萃取過程；

步驟S4：ATP檢測工作液的準(zhǔn)備；

步驟S5：eATP標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作；

步驟S6：樣品中eATP測定與計(jì)算；

步驟S1所述香蕉綠熟果實(shí)為采收時果實(shí)飽滿度為7~8成，落梳后分為單個蕉指；所述預(yù)處理具體為：用清水清洗，再用0.5 % NaClO溶液浸果3分鐘后迅速用紙巾吸干；挑選大小均勻、無病蟲害及機(jī)械傷的單果60個果，均分成2組；

步驟S2所述香蕉果皮圓片組織的標(biāo)準(zhǔn)化制作包括以下步驟：利用打孔器取每個香蕉果實(shí)上的小圓片，置于玻璃容器內(nèi)，加入超純水浸沒香蕉，輕輕搖晃洗滌3次后，去除破碎細(xì)胞所釋放出來的ATP，然后加入滅菌超純水，進(jìn)行真空滲透處理，使得香蕉果皮組織圓片全部浸沒在溶液中，分別置于常溫和低溫條件下50 rpm震蕩，分別在3、6 h從玻璃容器的溶液取1 mL于滅菌后的1 .5 mL離心管，重復(fù)3次；所述打孔器直徑為1.2 cm，所述真空滲透處理壓強(qiáng)為75 kPa，維持5 min；所述常溫為25 ℃，低溫為6 ℃；

步驟S3所述香蕉果皮組織eATP的萃取包括以下步驟：盛有溶液的離心管插入漂浮泡沫板，在100 ℃沸水中煮5 min，使ATP水解酶及其他激酶失活，阻止對ATP的損耗，12000 g，離心5 min，取上清液于新的離心管，即為eATP萃取液；

步驟S4所述ATP檢測工作液的準(zhǔn)備包括以下步驟：將ATP檢測試劑和ATP檢測稀釋液按照體積比1：9的比例混合，制備得到ATP檢測工作液；所述ATP檢測試劑為螢光素酶濃縮母液；所述檢測稀釋液為0.05 mol/L甘氨酰-甘氨酸緩沖液；所述0.05 mol/L甘氨酰-甘氨酸緩沖液的配制方法為：稱取0.6606 g甘氨酰-甘氨酸溶于60 mL超純水中，用0.2 mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH至7.6，再加入100 mg牛血清蛋白，120.4 mg MgSO₄，及33.6 mg EDTA-Na2，用超純水定容至100 mL；所述螢光素酶濃縮母液的配制方法為：粉劑熒光素酶按30 mg/mL溶解于上述緩沖液中；

步驟S5所述eATP標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作包括以下步驟：

（1）0.5 mM 的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液根據(jù)eATP的測定范圍分別稀釋成40、80、120、160、200nmol/L；

（2）緩緩加入100 μL ATP檢測工作液至白色不透明96孔板的檢測孔內(nèi)；室溫放置5min，使得本底的ATP全部被消耗掉，從而降低本底的影響；

（3）在檢測孔中緩緩加入100 μL ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液，防止有氣泡；

（4）等待5秒鐘后，使用化學(xué)發(fā)光儀測定RLU值，檢測時間為10秒；

（5）根據(jù)ATP的濃度和所測定的RLU值，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線；

步驟S6所述樣品中eATP測定與計(jì)算包括以下步驟：

（1）加入100 μL ATP檢測工作液至白色不透明96孔板的檢測孔內(nèi)；室溫放置5 min，使得本底的ATP全部被消耗掉，從而降低本底的影響；

（2）在白色不透明96孔板的檢測孔中緩緩加入100 μL eATP萃取液，防止有氣泡；

（3）等待5 秒鐘后，使用化學(xué)發(fā)光儀測定RLU值，檢測時間為10秒；

（4）根據(jù)步驟S5中的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品萃取液中的eATP含量y，計(jì)算公式y(tǒng)=13304×RLU-34750，單位為nmol。

2.一種如權(quán)利要求1所述方法在檢測香蕉采后果實(shí)eATP水平中的應(yīng)用。