[發明專利]一種生產雜合型N糖鏈修飾糖蛋白細胞株DFKO及其制備方法

有效

• 申請號: 202110286330.1
• 申請日: 2021-03-17
• 公開（公告）號: CN113215103B
• 公開（公告）日: 2023-03-31
• 發明（設計）人: 藤田盛久;冷繼雄;高曉冬;楊剛龍;柳藝石;任偉偉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12N15/12;C12N15/11
• 代理公司: 南京禹為知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32272
• 代理人: 劉峰

本發明公開了一種生產雜合型N糖鏈修飾糖蛋白細胞株DFKO及其制備方法，其制備方法包括，將靶序列連接到CRISPR?Cas9敲除系統的PX330?EGFP質粒中，轉染于HEK293野生型細胞中，轉染后利用流式分選儀進行篩選富集和有限稀釋，得到DFKO單克隆細胞。本發明在哺乳動物細胞HEK293中，利用CRISPR?Cas9技術敲除N糖基化路徑的MAN2A1、MAN2A2和FUT8基因，建立了三基因敲除細胞DFKO，該細胞可生產以雜合型且不含核心巖藻糖修飾為主要N糖鏈。該細胞株可應用于生產生物醫藥糖蛋白，能大大提高其穩定性和生物活性；特別地，由于DFKO細胞株喪失了核心巖藻糖修飾，利用該細胞株生產抗體，可以大大提高該抗體的ADCC效力。

技術領域

本發明屬于生物科技技術領域，具體涉及一種生產雜合型N糖鏈修飾糖蛋白細胞株 DFKO及其制備方法。

背景技術

蛋白質糖基化修飾是真核生物中高度保守的翻譯后修飾(post-translationalmodification, PTM)方式之一，在細胞生命活動中發揮重要作用。目前，生物醫藥糖蛋白的生產與發展的 關鍵性問題就是在于蛋白質的糖基化修飾。與受中心法則嚴格調控的轉率和翻譯過程不同， 蛋白質的糖基化修飾乃至于翻譯后修飾都是一個相對隨機的過程，蛋白是否被修飾只取決于 是否與相應的酶接觸充分，所以同一蛋白上發生的翻譯后修飾可能會不一致。

糖蛋白是生物體維持正常生命活動的一類重要的功能性蛋白。從結構上來看，糖蛋白是 由分支的寡糖鏈與多肽鏈共價相連接的復合蛋白，其中寡糖鏈和多肽鏈的連接方式有以下幾 種：N-糖苷鍵型、O-糖苷鍵型、GPI(糖基磷脂酰肌醇)錨定型和蛋白聚糖型。N-糖苷鍵型 修飾是真核生物中最為廣泛的的翻譯后修飾之一，其通常發生于肽鏈中天冬酰胺-X-絲氨酸/ 蘇氨酸(N-X-S/T，X可以是除了脯氨酸之外的任意氨基酸)這一保守氨基酸序列的天冬酰 胺的側鏈酰胺基團上。N-糖苷鍵型糖鏈(也稱為N糖鏈)具有五糖核心，主要包括三類寡 糖鏈：①高甘露糖型，由GlcNAC和甘露糖組成；②復合型糖型，除了GlcNAC和甘露糖外， 還有半乳糖和唾液酸等；③雜合型糖型，具有①和②的特征。

N糖鏈的合成是一系列由糖基轉移酶和糖苷酶催化的酶促反應結果，這些反應之間存在 著協同或競爭的關系，所以最終導致細胞內可合成各種高度復雜的糖鏈結構，稱為糖鏈微觀 不均一性。這種微觀不均一性直接影響生物制藥糖蛋白的藥效學和藥代動力學性質，如抗體 依賴的細胞毒性(Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity，ADCC)，補體依賴的細胞毒作用 (Complement-Dependent Cytotoxicity，CDC)以及其在體內的半衰期等。為解決糖鏈微觀不 均一性這一問題，改善生物制藥蛋白的穩定性，生物活性和免疫原性，研究者們提出了許多 關于N糖基化路徑改造的方法。Zong等人利用CRISPR/Cas9技術將CHO-S細胞的N-糖基 化路徑中FUT8基因進行敲除，使得蛋白上糖鏈的核心巖藻糖修飾喪失，從而得到了生產高 ADCC活性抗體藥物的細胞株。Jin和Ren等人在人胚胎腎細胞293(HEK293)細胞中敲除 了內質網和高爾基體的α1,2甘露糖苷酶，在敲除細胞中只檢測到高甘露糖型N糖鏈，使糖 鏈結構得以均一化和簡化，并且該作者在敲除細胞內過表達只攜帶高甘露糖型的重組溶酶體 酸性脂肪酶(LIPA)，這種酶可應用治療溶酶體貯積疾病。本發明具體主要涉及在哺乳動物 細胞中構建用于生產以雜合型且不含核心巖藻糖修飾為主要N糖鏈的糖蛋白的敲除細胞株， 以往的文獻或者專利都未曾報道過這樣的細胞株。

發明內容

本部分的目的在于概述本發明的實施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實施例。在本 部分以及本申請的說明書摘要和發明名稱中可能會做些簡化或省略以避免使本部分、說明書 摘要和發明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發明的范圍。

鑒于上述的技術缺陷，提出了本發明。

因此，作為本發明其中一個方面，本發明克服現有技術中存在的不足，提供一種生產雜 合型N糖鏈修飾糖蛋白細胞株DFKO及其制備方法。