[發明專利]一種生產雜合型N糖鏈修飾糖蛋白細胞株DFKO及其制備方法

有效

• 申請號: 202110286330.1
• 申請日: 2021-03-17
• 公開（公告）號: CN113215103B
• 公開（公告）日: 2023-03-31
• 發明（設計）人: 藤田盛久;冷繼雄;高曉冬;楊剛龍;柳藝石;任偉偉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12N15/12;C12N15/11
• 代理公司: 南京禹為知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32272
• 代理人: 劉峰

1.一種生產雜合型N糖鏈修飾糖蛋白細胞株DFKO的制備方法，其特征在于：利用CRISPR-Cas9敲除系統，敲除或破壞HEK293細胞的N糖基化路徑的基因，獲得敲除N糖基化路徑基因的細胞株DFKO；

其中，所述N糖基化路徑的基因為MAN2A1、MAN2A2和FUT8；

所述敲除或破壞細胞的N糖基化路徑的基因，其為先敲除MAN2A1和MAN2A2基因再敲除FUT8基因。

2.如權利要求1所述的生產雜合型N糖鏈修飾糖蛋白細胞株DFKO的制備方法，其特征在于：所述敲除或破壞，其為將guide-RNA的DNA序列連接到所述CRISPR-Cas9敲除系統的PX330-EGFP質粒中，再轉染于HEK293細胞中，EGFP陽性細胞株經篩選富集、有限稀釋，得到DFKO細胞株。

3.如權利要求2所述的生產雜合型N糖鏈修飾糖蛋白細胞株DFKO的制備方法，其特征在于：所述guide-RNA的DNA序列包括序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:20。

4.如權利要求2所述的生產雜合型N糖鏈修飾糖蛋白細胞株DFKO的制備方法，其特征在于：所述轉染，其使用的轉染試劑包括PEI-MAX、OPTI中的一種或幾種。

5.如權利要求4所述的生產雜合型N糖鏈修飾糖蛋白細胞株DFKO的制備方法，其特征在于：所述轉染，其包括以下步驟，

將PEI-MAX與OPTI混合稀釋，體積比為1：50，獲得第一混合液，靜置5~10分鐘；

將PX330-EGFP質粒稀釋于OPTI中，質粒使用量與OPTI比例為4ng：250μl，獲得第二混合液，靜置5~10分鐘；

混勻所述第一混合液和所述第二混合液，靜置15~30分鐘；

均勻加到HEK293細胞中。

6.一種生產雜合型N糖鏈修飾糖蛋白的細胞株DFKO，其特征在于：所述細胞株為MAN2A1/A2/FUT8基因三敲除細胞株人胚腎細胞293-MAN2A1A2FUT8-DFKO，于2020年7月13日保藏在中國典型培養物保藏中心，地址為中國·武漢·武漢大學，保藏編號為CCTCC No.C2020123。