[發明專利]一種用于提高枯草芽孢桿菌中重組蛋白表達量的培養基、配制方法及應用

在審

• 申請號: 202110286083.5
• 申請日: 2021-03-17
• 公開（公告）號: CN112852703A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 李銀生;吳宜釗;邱江平
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N1/38;C12P21/02;C12R1/125
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 胡晶

本發明提供了一種用于提高枯草芽孢桿菌中重組蛋白表達量的培養基、配制方法及應用。所述培養基的每1000mL體系中，培養基組成包括：玉米浸粉25?35g，豆粕提取物36?48g，麥芽糖40?60g，氯化鉀4?6g，硫酸銨3?5g，硫酸錳0.075?0.125g，氯化鈣0.075?0.125g，余量為去離子水。將用于表達重組蛋白的枯草芽孢桿菌，接種至所述的培養基中，28?36℃培養30?42h，然后將菌液離心取上清液，純化后得到重組蛋白表達量提高的菌液。使用本發明培養基，利用枯草芽孢桿菌表達重組蛋白時，表達量相對于LB培養基，重組蛋白表達量提高28?65％，培養基組分便宜易得，安全無毒，可以于大規模發酵。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及一種用于提高枯草芽孢桿菌中重組蛋白表達量的培養基及配制方法。

背景技術

目前，在原核表達系統中大腸桿菌(Escherichia coli)是應用最為廣泛，其具有眾多的優勢，例如培養條件需求低、操作簡單、表達周期短，基因產物表達量高等。但是大腸桿菌表達系統的缺點也不容忽視。利用大腸桿菌表達系統表達重組蛋白可能使非活性蛋白形成包涵體或聚合物，導致需要增加后續步驟，也有可能表達出非糖基化、錯誤折疊或無功能蛋白，同時大腸桿菌缺乏分泌表達的機制，導致獲得重組蛋白可能需要破碎菌體，并且大腸桿菌細胞壁具有內毒素，增加了純化難度。而且大腸桿菌在發酵過程會積累醋酸鹽，醋酸鹽會影響大腸桿菌生長和蛋白表達。

與大腸桿菌相比，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)同樣對培養條件需求低、表達周期短，并且細胞壁不含內毒素，可以將重組蛋白分泌到細胞外，由此可以簡化純化步驟。雖然枯草芽孢桿菌會分泌較多的蛋白酶，影響所合成的重組蛋白，但是已有蛋白酶缺陷菌株構建出來，通過采用此類菌株，能夠避免重組蛋白被分解。目前已有大量枯草芽孢桿菌的表達系統與表達方法被構建出來，例如楊明明等構建的枯草芽孢桿菌麥芽糖操縱元啟動子表達系統的β-半乳糖苷酶的表達量達到了接近于大腸桿菌商用高效表達系統pET28a的表達量；汪以真等發明了一種利用枯草芽孢桿菌表達外源蛋白的方法，減少了外源有害物或者不純物質的引入。

但是就目前的枯草芽孢桿菌表達方法而言，對于外源蛋白的表達多采用LB培養基培養，但是LB培養基所采用的胰蛋白胨和酵母提取物，價格較為昂貴，且重組蛋白產量較低，不適用于大規模生產發酵外源蛋白。基于上述枯草芽孢桿菌表達重組蛋白的過程中所存在的問題，為了降低發酵成本，提高重組蛋白的表達產量，需對用于枯草芽孢桿菌表達重組蛋白的培養基進行改進。

經過對現有技術的檢索，申請號為201610130056.8的發明專利公開了一種用于大腸桿菌分泌表達重組蛋白的培養基，培養基中每1000毫升含有：胰蛋白胨12-16克、酵母提取物6-10克、D-山梨醇60-100克、氯化鈉8-16克、D-葡萄糖1-2克、1mol/LTris-HCl緩沖液(pH7.2)20-100毫升、加去離子水至1000毫升。但是該培養基中，所采用的胰蛋白胨和酵母提取物，價格較為昂貴，且重組蛋白產量較低，最高不超過7mg/L。

發明內容

針對現有技術中的缺陷，本發明的目的是提供一種用于提高枯草芽孢桿菌中重組蛋白表達量的培養基、配制方法及應用。

本發明的目的是通過以下方案實現的：

本發明的第一方面提供一種用于提高枯草芽孢桿菌中重組蛋白表達量的培養基，所述培養基的每1000mL體系中，培養基組成包括：玉米浸粉25-35g，豆粕提取物36-48g，麥芽糖40-60g，氯化鉀4-6g，硫酸銨3-5g，硫酸錳0.075-0.125g，氯化鈣0.075-0.125g，余量為去離子水。其中，玉米浸粉作為碳源、豆粕提取物作為氮源、麥芽糖作為誘導物，添加氯化鉀、硫酸銨、硫酸錳、氯化鈣等無機鹽，pH＝6-8，可用于提高例如蚯蚓抗菌肽等重組蛋白的表達量。

優選地，所述培養基的每1000mL體系中，培養基組成包括：玉米浸粉30g，豆粕提取物42g，麥芽糖50g，氯化鉀5g，硫酸銨4g，硫酸錳0.1g，氯化鈣0.1g，余量為去離子水。