[發明專利]一種基于拉曼光譜法的miRNA的高靈敏度檢測方法

在審

• 申請號: 202110285828.6
• 申請日: 2021-03-17
• 公開（公告）號: CN113075191A
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發明（設計）人: 金永龍;殷古軒;繆雨揚;許田;王超男;許美鳳
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 許潔

本發明公開了一種基于拉曼光譜法的miRNA的高靈敏度檢測方法，本發明旨在運用表面增強拉曼散射技術，突破傳統手段檢測腫瘤指標miRNA費時長、靈敏度低、特異性差等缺點，利用互補DNA篩選目標miRNA并結合金納米顆粒增強表面拉曼散射技術，實現穩定準確檢測pM級別目標miRNA的靈敏度，為腫瘤的早期防治提供依據。

技術領域

本發明屬于拉曼光譜技術領域，具體涉及一種基于拉曼光譜法的miRNA的高靈敏度檢測方法。

背景技術

目前檢測miRNA的技術主要有Northern印跡雜交法、微陣列分析法、實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)等。這些方法或多或少有著操作上的困難和局限性。其中Northern印跡雜交法耗時費力、靈敏度低、樣品需求量大，且不能用于低豐度miRNA的測定；微陣列分析法靈敏度較低、特異性較差、動態范圍較窄、芯片制作和檢測費用高且重復性差；實時定量聚合酶鏈式反應中miRNA序列較短限制了其逆轉錄環節且qRT-PCR通常需要復雜的引物設計和精確的溫度控制。另外，PCR過程中非特異性擴增也容易導致假陽性。

本發明利用互補DNA篩選目標miRNA并結合金納米顆粒增強表面拉曼散射技術放大目標物的信號，實現目標分子低濃度的檢測，具有消耗小、靈敏度高、特異性強等特點。

發明內容

發明目的：本發明的目的是為了解決現有miRNA檢測技術操作復雜、靈敏度低、費時長等缺點，提供了一種基于拉曼光譜法的miRNA的高靈敏度檢測方法，利用特異性增強拉曼光譜技術實現超低濃度生物分子的檢測。

技術方案：一種基于拉曼光譜法的miRNA的高靈敏度檢測方法，包括如下步驟：

步驟一、確定目標miRNA并制備相應的一端巰基化的互補DNA；

步驟二、制備金納米顆粒AuNP，通過巰基與金的作用把互補DNA與金納米顆粒AuNP連接，得到連接了目標miRNA對應互補DNA的金納米顆粒DNA-AuNP(5)；

步驟三、給目標miRNA修飾生物素；

步驟四、利用生物素與鏈霉親和素的作用，把修飾了生物素的目標miRNA與表面修飾鏈霉親和素的磁珠BB-SA連接；

步驟五、將金納米顆粒DNA-AuNP溶液與連接了目標miRNA的磁珠BB-SA溶液混合，使得互補DNA與目標miRNA互補配對連接，得到連接了目標miRNA并結合了互補DNA的金納米顆粒DNA-AuNP的磁珠BB-miR-DNA-AuNP；

步驟六、利用磁珠的磁性，用磁分離技術分離出磁珠BB-miR-DNA-AuNP；

步驟七、將磁珠BB-miR-DNA-AuNP與拉曼探針分子溶液混合，測量其拉曼信號；雖然目標miRNA的濃度很低，但AuNP增強的是高濃度拉曼探針分子的拉曼信號，因此起到了對目標miRNA信號的放大作用；由于DNA-AuNPs只與目標miRNA互補特異性連接，增強拉曼信號的強弱直接反應了目標miRNA的濃度；

步驟八、制作增強拉曼信號與目標miRNA的濃度關系標準曲線；

步驟九、通過增強拉曼信號確定目標miRNA的濃度。

作為優化：所述的金納米顆粒(AuNP)的尺寸為30-120nm。

作為優化：所述的拉曼探針分子是拉曼活性較強的有機分子。

作為優化：所述的拉曼探針分子是結晶紫、羅丹明或者苯硫酚。

有益效果：本發明旨在運用表面增強拉曼散射技術，突破傳統手段檢測腫瘤指標miRNA費時長、靈敏度低、特異性差等缺點，利用互補DNA篩選目標miRNA并結合金納米顆粒增強表面拉曼散射技術，實現穩定準確檢測pM級別目標miRNA的靈敏度，為腫瘤的早期防治提供依據。

附圖說明