[發(fā)明專利]黃連堿作為熒光探針標(biāo)記真核細(xì)胞的方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110284231.X
• 申請(qǐng)日: 2021-03-17
• 公開（公告）號(hào): CN113049558B
• 公開（公告）日: 2022-05-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡延忠;李慧;安雙雙;李靜;崔秀坤;馬遠(yuǎn)方
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64;C09K11/06
• 代理公司: 鄭州浩德知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 41130
• 代理人: 柏瓊瓊

本發(fā)明提出了黃連堿及其類似物作為熒光探針在標(biāo)記真核細(xì)胞核核仁及DNA中的應(yīng)用，在真核細(xì)胞的固定細(xì)胞核核仁和/或活細(xì)胞核仁中標(biāo)記不同應(yīng)激狀態(tài)下核仁形態(tài)、大小和分布的變化。其中黃連堿及其類似物可進(jìn)入細(xì)胞，定位于活細(xì)胞核仁區(qū)，特異熒光標(biāo)記細(xì)胞核、細(xì)胞核仁，能夠?qū)畹幕蚪?jīng)固定液固定的哺乳類原代細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、酵母和培養(yǎng)的植物細(xì)胞核和核仁直接進(jìn)行熒光標(biāo)記，且不產(chǎn)生核仁應(yīng)激反應(yīng)，不抑制rRNA的合成，操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、經(jīng)濟(jì)、易制備試驗(yàn)重復(fù)性好。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及黃連堿作為熒光探針標(biāo)記真核細(xì)胞的方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

黃連堿(Coptisine)是從Coptis chinensis (CC)提取出來(lái)的天然小分子化合物，具有廣泛的藥理作用。在目前的研究中，黃連堿(Coptisine)能夠通過(guò)抑制MMP-3和MMP-9、下調(diào)PI3K和AKT 25、下調(diào)Bcl2及上調(diào)Bax，caspase‐3 等凋亡相關(guān)蛋白以及降低G1/S相關(guān)基因的表達(dá)等，阻止腫瘤的粘附和遷移、降低上皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到抗腫瘤的效果。黃連堿(Coptisine)可以通過(guò)阻斷NF‐κB, MAPK以及PI3K/AKT信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。黃連堿(Coptisine)也能阻斷ROCK通路，降低NADPH氧化酶和ROS水平來(lái)保護(hù)心血管。黃連堿(Coptisine)能通過(guò)抑制瘧疾化療靶點(diǎn)PfDHODH降低金黃色葡萄球菌粘附；黃連堿(Coptisine) 能夠通過(guò)調(diào)節(jié)IκBα/NF‐κB信號(hào)通路減輕腹瀉程度及回腸黏膜損傷。黃連堿(Coptisine) 能激活Nrf2信號(hào)通路導(dǎo)致下游基因heme oxygenase1和NADPH quinone oxidoreductase 1的上調(diào)改善糖尿病氧化性腎損傷。

真核細(xì)胞核仁是一個(gè)動(dòng)態(tài)、無(wú)膜結(jié)構(gòu)的復(fù)合體，被核內(nèi)異染色質(zhì)包圍。從里向外有三個(gè)區(qū)域：纖維中心（FC）、致密纖維組分（DFC）、顆粒組分（GC）。纖維中心（FC）是rRNA基因的儲(chǔ)存位點(diǎn)，主要有rDNA、RNA聚合酶I（Pol I）和結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。致密纖維組分（DFC）中主要有rRNA、核仁纖維蛋白（fibrillarin）、核仁蛋白（nucleolin）和Ag-NOR蛋白。顆粒組分（GC）是核仁的主要結(jié)構(gòu)，由RNP（RNA和蛋白質(zhì)復(fù)合物）構(gòu)成。核仁區(qū)是rDNA的轉(zhuǎn)錄、rRNA的合成與加工以及核糖體亞單位組裝場(chǎng)所。一直以來(lái)病理學(xué)家將核仁形態(tài)和數(shù)量變化作為相關(guān)疾病的標(biāo)志，如在癌癥中，核仁體積變大，數(shù)量增多以適應(yīng)蛋白質(zhì)合成及增殖的需要。腫瘤細(xì)胞核仁改變與RNA聚合酶I（Pol I）上游信號(hào)通路的激活、負(fù)調(diào)控rRNA腫瘤抑制因子的缺失以及核糖體蛋白高表達(dá)有關(guān)。核仁功能障礙也與許多疾病密切相關(guān)。例如核糖體蛋白突變、核糖體蛋白伴侶分子TSR2及造血轉(zhuǎn)錄因子GATA-1的突變都介導(dǎo)了先天性再生障礙性貧血（DBA）疾病的表型；RPS14基因的缺失導(dǎo)致5q-綜合征；SBDS及DNAJC21的突變影響60S核糖體蛋白的成熟導(dǎo)致Shwachman-Diamond 綜合征（SDS）的發(fā)生；合成rRNA相關(guān)基因TCOF1、POLR1D、POLR1C的突變導(dǎo)致特雷徹?柯林斯綜合征（TCS）疾病。此外在細(xì)胞周期調(diào)控、神經(jīng)損傷方面靶向核仁調(diào)控相關(guān)基因都有明顯的改善作用。

目前對(duì)核仁的形態(tài)的變化監(jiān)測(cè)手段主要是免疫組化或免疫熒光試驗(yàn)，這種方法主要利用核仁結(jié)構(gòu)蛋白如B23 和Fibrillarin。缺點(diǎn)是不能實(shí)時(shí)觀察活細(xì)胞核仁的變化。過(guò)表達(dá)B23-GFP/RFP或Fibrillarin-GFP/RFP可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞核仁，但是，受B23或Fibrilian蛋白合成和代謝的調(diào)控，GFP和RFP是否對(duì)核仁有影響也無(wú)法評(píng)估。

因此，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)核仁的狀態(tài)顯得尤為重要。目前靶向標(biāo)記核仁的方式有三種：一是針對(duì)核仁蛋白的抗體。但是抗體免疫標(biāo)記核仁有如下缺點(diǎn)，如抗體制備程序復(fù)雜，價(jià)格昂貴，受特異性影響。試驗(yàn)周期長(zhǎng)，并且只能免疫熒光標(biāo)記固定細(xì)胞，不能實(shí)時(shí)標(biāo)記活細(xì)胞。

二是過(guò)表達(dá)熒光蛋白（GFP、RFP）與核仁特異蛋白的融合蛋白。該方法適合活細(xì)胞標(biāo)記核追蹤細(xì)胞核仁的結(jié)構(gòu)和形態(tài)變化，不能用于固定細(xì)胞染色。該方法需要質(zhì)粒構(gòu)建，細(xì)胞轉(zhuǎn)染等程序，試驗(yàn)實(shí)施程序復(fù)雜。