[發明專利]黃連堿作為熒光探針標記真核細胞的方法及應用

有效

• 申請號: 202110284231.X
• 申請日: 2021-03-17
• 公開（公告）號: CN113049558B
• 公開（公告）日: 2022-05-03
• 發明（設計）人: 胡延忠;李慧;安雙雙;李靜;崔秀坤;馬遠方
• 申請（專利權）人: 河南大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C09K11/06
• 代理公司: 鄭州浩德知識產權代理事務所(普通合伙) 41130
• 代理人: 柏瓊瓊

1.黃連堿作為熒光探針在Hela腫瘤細胞分群中應用，其特征在于，黃連堿根據熒光強度區分所述Hela腫瘤細胞的異質性，并定位所述Hela腫瘤干細胞；包括步驟：

先將Hela腫瘤細胞鋪至10 cm大皿中；隔天將黃連堿母液用含10 % FBS的DMEM培養基稀釋成20μM/L工作液；每皿細胞加3ml PBS洗一次后加入8ml工作液，37℃，5%的CO₂孵育6h；

取出細胞并吸除培養基，每皿用3 ml PBS清洗后加入3 ml 含EDTA的0.25%胰酶消化2-5 min；向皿里加入3 ml 含10% FBS的DMEM培養基終止消化，

收集細胞至離心管中500 rpm離心5 min，倒掉上清，細胞用PBS重懸洗滌一次500 rpm離心5min后倒掉上清，并加入1 ml PBS重懸細胞0.45 μm濾膜過濾,后轉移至流式管中按黃連堿熒光強弱進行流式分選，并進行平板克隆和軟瓊脂實驗；

平板克隆實驗：將流式分選的三群細胞用含10 % FBS的DMEM培養基稀釋并分別計數；每組取1500個細胞加入9 ml的培養基制成細胞懸液；取新的孔板各組每孔3 ml細胞懸液均勻加入到三個孔中使細胞充分分散，并在37℃，5%的CO₂培養2周，期間及時補充培養基；

終止培養后將孔板中的培養基吸除，每孔用1 ml的PBS洗兩次，加入2 ml的甲醇固定20min，之后吸除甲醇，用PBS洗兩次，每孔加入2 ml的結晶紫染色30 min，回收結晶紫，加入PBS脫色搖床清洗三次，每次5 min；晾干拍照，計算克隆數及克隆形成率；

軟瓊脂實驗：提供1.2%和0.6 %的瓊脂溶液和配方為1 ml培養基中加200 μL胎牛血清FBS、20 μL雙抗PS、2X DMEM 780 μL的培養基，首先鋪下層膠，即取等體積的1.2%瓊脂溶液和培養基混合，按每孔3 ml加入到六孔板中待其凝固；將分選的三群細胞利用培養基稀釋后計數；

取等體積的0.6%瓊脂溶液和培養基混合，按每孔接種50000個細胞加入其中混合均勻；按每孔3 ml分別加入到鋪有所述下層膠上作為上層膠待其凝固，后在所述上層膠上加入2ml DMEM培養基；37℃，5%的CO₂培養2周，期間不斷觀察各孔克隆形成情況及表面液體揮發情況及時補液，計算結果并統計。