[發(fā)明專利]陸地棉轉(zhuǎn)化體R1-3及其鑒定方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202110283432.8 | 申請日： | 2021-03-16 |
| 公開（公告）號： | CN113584071A | 公開（公告）日： | 2021-11-02 |
| 發(fā)明（設計）人： | 馬燕斌;文晉;李換麗;吳霞;王新勝 | 申請（專利權(quán)）人： | 山西省農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所 |
| 主分類號： | C12N15/82 | 分類號： | C12N15/82;A01H5/00;A01H6/60;C12Q1/6895;C12Q1/686 |
| 代理公司： | 北京彭麗芳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11407 | 代理人： | 彭麗芳 |
| 地址： | 044000 山西*** | 國省代碼： | 山西;14 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 陸地棉 轉(zhuǎn)化 r1 及其 鑒定 方法 | ||
本發(fā)明涉及棉花育種領(lǐng)域，具體涉及一種陸地棉轉(zhuǎn)化體R1?3及其鑒定方法，該陸地棉轉(zhuǎn)化體R1?3由耐草甘膦基因G10evo?EPSPS導入棉花中而得到，耐草甘膦基因G10evo?EPSPS的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本發(fā)明采用農(nóng)桿菌介導法將抗除草劑草甘膦的基因G10evo?EPSPS作為抗性選擇基因?qū)肷轿魇∞r(nóng)科院棉花所自選陸地棉R15材料中，獲得了轉(zhuǎn)G10evo?EPSPS基因的R1?3耐草甘膦棉花新材料，該材料在田間鑒定中，對草甘膦除草劑具有極高的抗性，在田間使用濃度的6?10倍依然表現(xiàn)為高抗性。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及棉花育種領(lǐng)域，具體涉及一種陸地棉轉(zhuǎn)化體R1-3及其鑒定方法。
背景技術(shù)
棉花是我國重要的糧食兼飼料作物，種植范圍廣。目前，中國棉花生產(chǎn)受機械化程度較低和勞動力成本增加等因素的影響，導致生產(chǎn)成本較高而經(jīng)濟效益較低，種植面積逐年下降；因此，為滿足中國棉花種植生產(chǎn)的潛在競爭需求，迫切需要培育和推廣具有抗草甘膦除草劑特性的棉花新品種。
抗草甘膦除草劑棉花是我國目前市場急需的。它的迅速推廣和應用，可以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟和社會效益。該轉(zhuǎn)基因棉花的培育可減少我國棉花生產(chǎn)因人工投入，還有利于擴大棉花的種植范圍，促進我國棉花持續(xù)穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)和持續(xù)發(fā)展。
發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種陸地棉轉(zhuǎn)化體R1-3及其鑒定方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
陸地棉轉(zhuǎn)化體R1-3，由耐草甘膦基因G10evo-EPSPS導入棉花中而得到，耐草甘膦基因G10evo-EPSPS的核苷酸序列如SEQ ID N0：1所示。
本發(fā)明還提供了上述陸地棉轉(zhuǎn)化體R1-3的鑒定方法，包括如下步驟：
S1、取轉(zhuǎn)基因棉花R1-3的新鮮葉片，用液氮充分研磨至細粉狀，裝入50ml 離心管中；加入100-200ulβ-巰基乙醇，按6mg/g樣的比例加入4℃預冷的抽提緩沖液，劇烈振蕩均勻，4℃下3500轉(zhuǎn)離心10分鐘，倒去上清；按5ml/g 樣的比例加入預熱到65℃的裂解緩沖液，并迅速攪拌均勻，65℃水浴30min 或更長到60min，每隔10min輕輕搖動一次；加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶ 1)，輕輕上下顛倒混勻至下部溶液變成黑色；3500轉(zhuǎn)，室溫離心10分鐘，取上清至新管，重新加入等體積的氯仿：異戊醇(24：1)，輕輕搖動直至混勻為一相；
取上清至新管，加入2/3體積-20℃的異丙醇，輕輕上下顛倒混勻，-20℃冷凍30分鐘后，將DNA轉(zhuǎn)移至新管，用75％乙醇10ml浸泡來洗鹽和去雜，每 2-3小時換一次，換2-3次或至DNA為白色，酒精清澈為止，待DNA風干至透明狀時用2ml PH8.0的TE溶解，然后加10ul濃度為10ug/ul的RNase，37℃水浴30分鐘后，在沸水中煮10分鐘以去除DNase；
加入等體積的氯仿：異戊醇(24：1)，輕輕混勻后，3500轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清至新管；加入1/10體積的3M的NaAC(PH5.2)和2倍體積冰凍無水乙醇，輕搖可見DNA沉淀；勾出DNA，用76％乙醇浸泡1-2次，風干后加200ulTE溶解，得目的基因DNA；
S2、根據(jù)目的基因G10evo序列設計引物，對轉(zhuǎn)基因棉花R1-3的T6-T7代材料的葉片DNA進行PCR擴增檢測，基因檢測引物779-F： 5′-CTCTTCTTCCTGACGGACTC-3′；1481-R：5′-GACTTTCTGATGTGGTGTGC-3′， PCR反應體系為20μl，2×MiX 10μl，引物各0.5μl，DNA模板0.5μl，加ddH2O 補足20μl。
PCR擴增條件是：95℃預變性3min；94℃變性50s，59℃退火50s，72℃延伸50s，28個循環(huán)；72℃延伸5min，16℃保存，0.8-1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
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