[發明專利]陸地棉轉化體R1-3及其鑒定方法

在審

• 申請號: 202110283432.8
• 申請日: 2021-03-16
• 公開（公告）號: CN113584071A
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 馬燕斌;文晉;李換麗;吳霞;王新勝
• 申請（專利權）人: 山西省農業科學院棉花研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/60;C12Q1/6895;C12Q1/686
• 代理公司: 北京彭麗芳知識產權代理有限公司 11407
• 代理人: 彭麗芳

1.陸地棉轉化體R1-3，其特征在于：由耐草甘膦基因G10evo-EPSPS導入棉花中而得到，耐草甘膦基因G10evo-EPSPS的核苷酸序列如SEQ ID N0：1所示。

2.如權利要求1所述的陸地棉轉化體R1-3的鑒定方法，其特征在于：包括如下步驟：

S1、取轉基因棉花R1-3的新鮮葉片，用液氮充分研磨至細粉狀，裝入50ml離心管中；加入100-200ul β-巰基乙醇，按6mg/g樣的比例加入4℃預冷的抽提緩沖液，劇烈振蕩均勻，4℃下3500轉離心10分鐘，倒去上清；按5ml/g樣的比例加入預熱到65℃的裂解緩沖液，并迅速攪拌均勻，65℃水浴30min或更長到60min，每隔10min輕輕搖動一次；加入等體積的氯仿：異戊醇(24：1)，輕輕上下顛倒混勻至下部溶液變成黑色；3500轉，室溫離心10分鐘，取上清至新管，重新加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，輕輕搖動直至混勻為一相；

取上清至新管，加入2/3體積-20℃的異丙醇，輕輕上下顛倒混勻，-20℃冷凍30分鐘后，將DNA轉移至新管，用75％乙醇10ml浸泡來洗鹽和去雜，每2-3小時換一次，換2-3次或至DNA為白色，酒精清澈為止，待DNA風干至透明狀時用2ml PH8.0的TE溶解，然后加10ul濃度為10ug/ul的RNase，37℃水浴30分鐘后，在沸水中煮10分鐘以去除DNase；

加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，輕輕混勻后，3500轉離心10分鐘，取上清至新管；加入1/10體積的3M的NaAC(PH5.2)和2倍體積冰凍無水乙醇，輕搖可見DNA沉淀；勾出DNA，用76％乙醇浸泡1-2次，風干后加200ulTE溶解，得目的基因DNA；

S2、根據目的基因G10evo-EPSPS序列設計引物，對轉基因棉花R1-3的T6-T7代材料的葉片DNA進行PCR擴增檢測，基因檢測引物779-F：5′-CTCTTCTTCCTGACGGACTC-3′；1481-R：5′-GACTTTCTGATGTGGTGTGC-3′，PCR反應體系為20μl，2×MiX 10μl，引物各0.5μl，DNA模板0.5μl，加ddH₂O補足20μl；

PCR擴增條件是：95℃預變性3min；94℃變性50s，59℃退火50s，72℃延伸50s，28個循環；72℃延伸5min，16℃保存，0.8-1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。