[發(fā)明專利]一種由雙熒光素酶報告基因檢測雞RIPK2啟動子活性的方法

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• 申請日: 2021-03-16
• 公開（公告）號: CN112877332A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發(fā)明（設計）人: 孫紅艷;李歡;牛英杰;左其生;張亞妮;李碧春
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/66;C12N15/65;C12Q1/66
• 代理公司: 揚州蘇中專利事務所(普通合伙) 32222
• 代理人: 沈志海

本發(fā)明提供一種由雙熒光素酶報告基因檢測雞RIPK2啟動子活性的方法，包括以下步驟：步驟1）、雞RIPK2基因啟動子全長的克隆；步驟2）、雞RIPK2啟動子區(qū)系列缺失片段報告質粒的構建和鑒定；步驟3）、雞RIPK2啟動子活性定性分析；步驟4）、雙熒光素酶報告基因檢測雞質粒RIPK2啟動子的活性；步驟5）、雞RIPK2核心啟動子區(qū)的確定；步驟6）、雞RIPK2核心啟動子區(qū)轉錄因子的篩選；利用軟件TRANSFAC和AliBaba 2.1對雞RIPK2啟動子區(qū)轉錄因子結合位點進行預測分析。通過本發(fā)明，便于對雞RIPK2基因啟動子的調控方式及調控元件進行研究。具有靈敏度高、準確性強、檢測迅速、費用較低等特點，避免了轉染效率對結果的影響。

技術領域

本發(fā)明涉及一種由雙熒光素酶報告基因檢測雞RIPK2啟動子活性的方法，屬于基因工程領域。

背景技術

RIPK2是RIPK激酶家族的一個成員，主要通過NOD/RIPK2通路進行免疫炎癥調節(jié)。抑制RIPK2基因可減少各種炎癥因子的釋放和緩解炎癥反應綜合征。而高表達RIPK2時可激活p38 MAPK通路，能更有效的清除大腸桿菌。這表明RIPK2對胞內菌的識別、炎癥反應的緩解以及其NOD/RIPK2通路對宿主免疫的調節(jié)都發(fā)揮著關鍵作用。因此，調控基因RIPK2的表達對機體免疫炎癥的調節(jié)具有重要實踐意義。

基因表達是一個受時間和空間等多因素調控的復雜過程。基因是否表達通常由特定啟動子是否啟動來決定的。轉錄因子可以特異性結合啟動子區(qū)的DNA序列，并協(xié)助RNA聚合酶在啟動子區(qū)啟動基因轉錄。啟動子本身并不控制基因活動，而是通過轉錄因子結合位點與轉錄因子結合來控制基因活動。轉錄因子結合位點的改變可直接影響轉錄因子的結合，繼而改變基因的轉錄效率并引起基因表達的差異。因此，篩選啟動子核心區(qū)域即驗證啟動子最大活性區(qū)域對進一步探究基因的表達調控具有非常重要的現(xiàn)實意義。

雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)使實驗報告基因測試的結果歸一化，具有檢測速度快、靈敏度高等特點，且在哺乳動物中已應用的十分純熟。本方法將雞RIPK2基因啟動子區(qū)系列缺失片段連接到熒光素酶報告載體pGL3-basic上，轉染免疫細胞，檢測熒光素酶活性，以確定雞RIPK2基因啟動子核心區(qū)域，為篩選調控雞RIPK2表達的因素提供了一種快速便捷的方法。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于針對上述問題，提供一種由雙熒光素酶報告基因檢測雞RIPK2啟動子活性的方法，本發(fā)明利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，將不同長度的雞RIPK2啟動子插入熒光素酶報告質粒，檢測熒光素酶表達量來確定啟動子活性，為篩選調控雞RIPK2表達的因素提供了一種快速便捷的方法。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，一種由雙熒光素酶報告基因檢測雞RIPK2啟動子活性的方法，靈敏度高、檢測迅速且費用較低，包括以下步驟：

步驟1)、雞RIPK2基因啟動子全長的克隆；

利用軟件TFSEARCH和PROSCAN分析雞RIPK2基因啟動子區(qū)域，利用Primer 5.0設計啟動子區(qū)引物，具體為固定3′端，從5′端開始設計，每次截短500bp設計啟動子區(qū)系列缺失片段7對引物，由上海生物工程有限公司合成；提取雞巨噬細胞系HD11基因組DNA；PCR擴增出雞RIPK2啟動子區(qū)系列缺失片段；瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物；對產物進行純化；送上海生物工程有限公司進行測序分析；

步驟2)、雞RIPK2啟動子區(qū)系列缺失片段報告質粒的構建和鑒定；

將提純后的不同長度的啟動子片段和pGL3-basic連接，進行單酶切和雙酶切，構建含有RIPK2啟動子不同長度的不同重組質粒，并對其進行篩選和鑒定。

步驟3)、雞RIPK2啟動子活性定性分析；

將雞RIPK2啟動子全長的重組質粒轉染至雞巨噬細胞系HD11，48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達狀態(tài)；