[發(fā)明專利]一種由雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)雞RIPK2啟動(dòng)子活性的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110283164.X
• 申請(qǐng)日: 2021-03-16
• 公開（公告）號(hào): CN112877332A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫紅艷;李歡;牛英杰;左其生;張亞妮;李碧春
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/85;C12N15/66;C12N15/65;C12Q1/66
• 代理公司: 揚(yáng)州蘇中專利事務(wù)所(普通合伙) 32222
• 代理人: 沈志海

1.一種由雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)雞RIPK2啟動(dòng)子活性的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1）、雞RIPK2基因啟動(dòng)子全長(zhǎng)的克??；

利用軟件TFSEARCH和PROSCAN分析雞RIPK2基因啟動(dòng)子區(qū)域，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)啟動(dòng)子區(qū)引物，具體為固定3′ 端，從5′ 端開始設(shè)計(jì)，每次截短500bp設(shè)計(jì)啟動(dòng)子區(qū)系列缺失片段7對(duì)引物；提取雞巨噬細(xì)胞系HD11基因組DNA；PCR擴(kuò)增出雞RIPK2啟動(dòng)子區(qū)系列缺失片段；瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化；

步驟2）、雞RIPK2啟動(dòng)子區(qū)系列缺失片段報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定；

將提純后的不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段和pGL3-basic連接，進(jìn)行單酶切和雙酶切，構(gòu)建含有RIPK2啟動(dòng)子不同長(zhǎng)度的不同重組質(zhì)粒，并對(duì)其進(jìn)行篩選和鑒定；

步驟3）、雞RIPK2啟動(dòng)子活性定性分析；

將雞RIPK2啟動(dòng)子全長(zhǎng)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至雞巨噬細(xì)胞系HD11，48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)狀態(tài)；

步驟4）、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)雞質(zhì)粒RIPK2啟動(dòng)子的活性；

將雞RIPK2啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒和pRL-TK共轉(zhuǎn)染至雞巨噬細(xì)胞系HD11中，24h后裂解細(xì)胞，并收集裂解液進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè)；

步驟5）、雞RIPK2核心啟動(dòng)子區(qū)的確定；

（1）構(gòu)建雞RIPK2 5′ 端缺失片段載體；

對(duì)雞RIPK2 5′ 端每隔500bp進(jìn)行截短并設(shè)計(jì)特異性引物，構(gòu)建重組報(bào)告質(zhì)粒，分別命名為pGL3-basic-RIPK2-WT、pGL3-basic-RIPK2-1、pGL3-basic-RIPK2-2、pGL3-basic-RIPK2-3、pGL3-basic-RIPK2-4、pGL3-basic-RIPK2-5、pGL3-basic-RIPK2-6并進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)；

用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，并檢測(cè)熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)活性；

通過對(duì)雞RIPK2缺失片段載體啟動(dòng)子活性統(tǒng)計(jì)分析，初步確定RIPK2核心啟動(dòng)子位置；

步驟6）、雞RIPK2核心啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子的篩選；

利用軟件TRANSFAC和AliBaba 2.1對(duì)雞RIPK2啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種由雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)雞RIPK2啟動(dòng)子活性的方法，其特征在于，步驟4）中，所述的雙熒光素酶報(bào)告基因?yàn)镽enilla熒光素酶基因。