[發明專利]一種快速通用的低豐度突變檢測方法

有效

• 申請號: 202110282855.8
• 申請日: 2021-03-16
• 公開（公告）號: CN113481280B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 汪宏波;章偉;舒灣;趙蓉
• 申請（專利權）人: 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院
• 主分類號: C12Q1/6827
• 分類號: C12Q1/6827;C12Q1/682
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所(普通合伙) 42001
• 代理人: 狄宗祿

本發明公開了一種快速通用的低豐度突變檢測方法。它包括如下步驟，步驟一：制備單脫堿基的雙標記熒光探針；步驟二：設計所需的突變鏈，野生鏈，引導鏈，橋梁鏈和阻遏鏈；步驟三：配置液體；步驟四：制備濃度為500nm混合樣本；步驟五：加入阻遏鏈；步驟六：將引導鏈和橋梁鏈混合配置成混合液；步驟七：將混合液靜置；步驟八：將步驟四配置的混合液分別加入到步驟七處理的混合液，配置成混合液；步驟九：在步驟七的混合液中加入步驟一制得的探針；步驟十：在步驟八的混合液中加入酶；步驟十一：將步驟九的液體加入到檢測管中檢測熒光曲線；步驟十二：得到突變點的熒光曲線。本發明具有能高選擇性、快速、低成本地檢測目標DNA序列的優點。

技術領域

本發明涉及核酸序列檢測領域，更具體地說涉及DNA序列的識別，單核苷酸多態性(SNP)分型以及低豐度點突變多重檢測等技術領域。更具體地說它是一種快速通用的低豐度突變檢測方法。

背景技術

隨著基因組學的發展，越來越多的臨床證據表明癌癥和遺傳性疾病與DNA點突變密切相關。因此，檢測驅動基因的點突變對癌癥的早期診斷，治療以及預后評價具有重要意義。但是，突變DNA在人體中一般是呈現低豐度的。在提取的DNA樣品中突變DNA的百分比非常低，在癌癥的早期階段可能不足1％。因此，在組織活檢或液體活檢中，檢測DNA點突變的方法要具有超高的鑒別突變型DNA 和野生型DNA的能力。

目前，研究人員已經開發出許多方法來檢測低豐度點突變。傳統的檢測方法的原理是通過單個突變堿基造成的野生鏈和突變鏈之間存在熱力學差異，運用PCR技術來區分野生鏈和突變鏈。這些檢測方法具有操作極為簡單、通用性好、成本低廉的特點，因而得到了非常廣泛的應用。但是PCR擴增子的長度一般為100到200bp，單個突變堿基所造成的熱力學差異很小，因而這些方法的靈敏度不高。更重要的是，傳統檢測方法無法區分目標擴增子和非特異性產物，PCR 體系中常見的副產物如引物二聚體會對該方法造成嚴重干擾，因此這些方法的特異性區分能力并不理想，檢測限僅為1％左右。近年來研究人員開發了基于下一代測序(NGS)的方法，已將測序的檢測限大大降。但它所需的儀器非常昂貴，反過來又增加了檢測成本，且檢測過程復雜，耗時長。

針對傳統檢測方法和下一代測序方法存在的局限，越來越多的研究人員轉向PCR后檢測，例如DNA探針，分子信標，Toehold交換探針等等。在這些方法中，DNA探針因其特異性強，靈敏度高而被廣泛采用。初步的DNA探針的工作原理是基于由DNA探針與野生型DNA不匹配引起的熱力學變化。而酶的實用性為提高基于DNA 探針的PCR后檢測方法的鑒別能力又提供了額外的工具。通過將 DNA探針熱力學判別與酶學信號放大技術偶聯在一起，大大提高了檢測限，且簡單，快捷。基于限制性核酸內切酶，皮瓣內切核酸酶，內切酶IV，Lambda核酸外切酶和連接酶組合方法現已建立。

但是酶聯DNA探針法必須對每個突變位點設計特異性的探針。這不僅意味著需要合成多種探針增加了檢測成本，而且優化過程中不斷調整探針序列會大幅增加優化的難度和成本，并使多重檢測更加困難。因此，酶聯DNA探針法相比于傳統檢測方法和下一代測序方法，雖然其具有更低的檢測線，更好的特異性，但是高昂的檢測、優化成本又很大程度地削弱了其具有的優勢，限制了其發展。

因此，目前缺乏一種通用型的，快速和高靈敏的DNA突變檢測方法，這是臨床基因檢測應用丞待解決的重要科學難題。

發明內容

本發明的目的是為了提供一種快速通用的低豐度突變檢測方法，首先利用Holliday交叉鏈遷移技術區分不同的核酸序列，然后利用內切酶IV與單脫堿基探針將信號放大；這是一種針對不同核酸序列的通用型放大體系，實現超高選擇性、快速、低成本的檢測目標DNA 序列；解決現有的DNA突變檢測技術無法兼具特異性、高靈敏度、通用性、快速低成本的技術問題。

為了實現上述目的，本發明的技術方案為：一種快速通用的低豐度突變檢測方法，其特征在于：包括如下步驟，

步驟一：制備單脫堿基的雙標記熒光探針，