[發(fā)明專利]一種快速通用的低豐度突變檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110282855.8
• 申請(qǐng)日: 2021-03-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113481280B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-06-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪宏波;章偉;舒灣;趙蓉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6827
• 分類號(hào): C12Q1/6827;C12Q1/682
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所(普通合伙) 42001
• 代理人: 狄宗祿

1.一種非疾病診斷目的的快速通用的低豐度突變檢測(cè)方法，其特征在于：包括如下步驟，

步驟一：制備單脫堿基的雙標(biāo)記熒光探針，

探針為單鏈DNA，一端標(biāo)記熒光基團(tuán)，另一端標(biāo)記猝滅基團(tuán)，脫堿基位點(diǎn)距離探針5’末端和3’末端5個(gè)核苷酸殘基以上；

步驟二：挑選二個(gè)突變點(diǎn)PTEN130Q（GA）、BRCA1/c.2082CT為驗(yàn)證靶點(diǎn)，在Pubmed網(wǎng)站上查詢PTEN130Q（GA）、BRCA1/c.2082CT二個(gè)突變點(diǎn)序列，依據(jù)實(shí)驗(yàn)原理分別設(shè)計(jì)所需的突變鏈，野生鏈，引導(dǎo)鏈，橋梁鏈和阻遏鏈；

其中，PTEN130Q（GA）突變位點(diǎn)基因的突變鏈-1的序列為：AGCTGGAAAGGGACAAACTGGTGT AATGA；

野生鏈-1的序列為：AGCTG GAAAGGGACGAACTGGTGT AATGA；

引導(dǎo)鏈-1的序列為：ACTGGTGTCGGA AGTG GCTG GAAAGGGA；

橋梁鏈-1的序列為：

AGTTTGTCCCTTTCCAGCTCCGACACCAGTTTG TCC；

阻遏鏈-1的序列為：CCAGTTCGTCCCT；

BRCA1/c.2082CT位點(diǎn)基因的突變鏈-2的序列為：

AAAAGACATGACAGTGATACTTTCCCAGA；

野生鏈-2的序列為：

AAAAGACATGACAGCGATACTTTCCCAGA；

引導(dǎo)鏈-2的序列為：

ATACTTTCCCGGAAGTGGCTGGACATGACA；

橋梁鏈-2的序列為：

AGTATCACTGTCATGTCCAGCTCCGGGAAAGTAT CAC TGTCA；

阻遏鏈-2的序列為：AGTATCGCTGTCA；

步驟三：用稀釋液稀釋步驟二所設(shè)計(jì)合成的鏈粉末，配置成液體，然后用Nanodrop測(cè)定濃度；

步驟四：分別使用步驟三PTEN130Q（GA）、BRCA1/c.2082CT二個(gè)突變點(diǎn)的野生鏈溶液來(lái)稀釋突變鏈溶液，制備一系列濃度為200nm混合樣本，樣本突變豐度范圍為100％至0.01％；

步驟五：分別向步驟四配置的不同混合樣本中加入步驟二設(shè)計(jì)的阻遏鏈，阻遏鏈的濃度為400nm；

步驟六：分別將步驟二設(shè)計(jì)合成的PTEN130Q（GA）、BRCA1/c.2082CT二個(gè)突變點(diǎn)的引導(dǎo)鏈和橋梁鏈混合配置成濃度為100nm的混合液，然后進(jìn)行升溫退火；

步驟七：將步驟六中升溫退火后的混合液放置于37°恒溫箱中靜置30min，使得步驟六中的引導(dǎo)鏈和橋梁鏈結(jié)合的更緊密；

步驟八：將步驟五配置的混合液一一對(duì)應(yīng)分別加入到步驟七處理的混合液，配置成各條鏈濃度為100nm的混合液；

步驟九：在步驟八的混合液中分別加入步驟一制得的探針，探針的最終濃度為100nm；

步驟十：在步驟九的混合液中加入酶，酶加到管壁，不掉落下去，并在37°恒溫箱中賦予1min，目的是使液體溫度初始溫度達(dá)到37°C；

步驟十一：將盛裝步驟十液體的離心管離心10s，轉(zhuǎn)移至檢測(cè)管中，然后將檢測(cè)管放置于儀器中檢測(cè)熒光曲線；

步驟十二：最后得到PTEN130Q（GA）、BRCA1/c.2082CT二個(gè)突變點(diǎn)的熒光曲線。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速通用的低豐度突變檢測(cè)方法，其特征在于：探針的長(zhǎng)度設(shè)置為11-15核苷酸殘基。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速通用的低豐度突變檢測(cè)方法，其特征在于：熒光基團(tuán)及其猝滅基團(tuán)滿足熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜與猝滅基團(tuán)的吸收光譜有效重疊；

熒光基團(tuán)及其猝滅基團(tuán)選自FAM與TAMRA，F(xiàn)AM與BHQ1或TET與BHQ2。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速通用的低豐度突變檢測(cè)方法，其特征在于：在步驟十中，酶選用內(nèi)切酶IV、Lambda核酸外切酶或核酸切刻酶。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的快速通用的低豐度突變檢測(cè)方法，其特征在于：在步驟六中，升溫退火過(guò)程為85°C、3min，55°C、3min。