[發明專利]一種基于MIRA熒光法快速檢測PCV3病毒的引物和探針

在審

• 申請號: 202110281107.8
• 申請日: 2021-03-16
• 公開（公告）號: CN112961941A
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 涂健;趙艷利;祁克宗;宋祥軍;劉紅梅;邵穎;楊侃侃;牛香鵬;李雅男
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 安徽申策知識產權代理事務所(普通合伙) 34178
• 代理人: 程艷梅

1.一種基于MIRA熒光法快速檢測PCV3病毒的引物和探針，其特征在于：包括四對引物和一個探針，四對引物和一個探針的基因序列具體如下：

第一對引物：

PCV3-MIRA-F1：5'-GTACCAGATCGGATCTTCAAGCAGCAGCT-3'；

PCV3-MIRA-R1：5'-GCAATTCATCAAATGGAACCCACCCATAA-3'；

第二對引物：

PCV3-MIRA-F2：5'-GGGGGATTACCTCGAGATTGGCGAAGATT-3'；

PCV3-MIRA-R2：5'-GTTTACCCAACCCCATCACCCCGCAAAAA-3'；

第三對引物：

PCV3-MIRA-F3：5'-CTTCGGGTACCAGATCGGATCTTCAAGCAGCAG-3'；

PCV3-MIRA-R3：5'-CCTGTCCCCAATTCTCAGCAATTCATCAAATGGA-3'；

第四對引物：

PCV3-MIRA-F4：5'-AGATTCCTCTTCGGGTACCAGATCGGATCTTCAA-3'；

PCV3-MIRA-R4：5'-GTTTACCCAACCCCATCACCCCGCAAAA-3'；

探針序列：

PCV3-probe：ACTGAAGTTGCGGAGAAGATGCCTGCAGTATTTATACGCTATGGGCGG；

探針修飾：

PCV3-probe：ACTGAAGTTGCGGAGAAGATGCCTGCAGTA[FAM-dT][THF][BHQ1-dT]ATACGCTATGGGCGG[C3spacer]。

2.根據權利要求1所述的一種基于MIRA熒光法快速檢測PCV3病毒的引物和探針，其特征在于：所述第一對引物的目的片段大小為345bp，所述第二對引物的目的片段大小為185bp，所述第三對引物的目的片段大小為368bp，所述第四對引物的目的片段大小為161bp。

3.一種基于MIRA熒光法快速檢測PCV3病毒的引物和探針的擴增反應方法，其特征在于，包括所述權力要求1中的四對引物和探針，具體如下：

S1、每個干粉反應管加入14.7μl A buffer；

S2、每個反應管分別加入1μl上游引物、1μl下游引物和0.3μl探針；

S3、向反應管中依次加入5.75μl ddH₂O和1μl核酸模板；

S4、最后向反應管中加入1.25μl B buffer并充分混合；

S5、混勻后，將反應液甩至管子底部，然后立即將反應管放入熒光檢測設備中。

4.根據權利要求3所述的一種基于MIRA熒光法快速檢測PCV3病毒的引物和探針的擴增反應方法，其特征在于：所述上游引物、所述下游引物和所述探針的濃度均為10μM，對于多個反應，步驟S1和步驟S2可以混合后再分裝至反應管中。

5.根據權利要求3所述的一種基于MIRA熒光法快速檢測PCV3病毒的引物和探針的擴增反應方法，其特征在于：所述步驟S3可以根據核酸濃度調整加入的核酸模板體積，并相應調整加入的ddH₂O體積，至模板與ddH₂O總體積為6.75μl。

6.根據權利要求3所述的一種基于MIRA熒光法快速檢測PCV3病毒的引物和探針的擴增反應方法，其特征在于：所述步驟S4中的混合過程為：上下顛倒甩動反應管8-10次進行混勻，對于多個反應，將B buffer加至反應管的蓋子內側上下顛倒后混勻。

7.根據權利要求3所述的一種基于MIRA熒光法快速檢測PCV3病毒的引物和探針的擴增反應方法，其特征在于：所述步驟S5中可采用快速離心的方式將反應液甩至管子底部。

8.根據權利要求3所述的一種基于MIRA熒光法快速檢測PCV3病毒的引物和探針的擴增反應方法，其特征在于：所述步驟S5中熒光檢測設備的程序設置為：恒溫39℃；每30s采集一次FAM通道熒光值；反應時間為20min。