[發(fā)明專利]一種isPLA-Seq的高通量檢測蛋白質相互作用的方法和試劑盒及其應用

有效

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• 申請日: 2021-03-15
• 公開（公告）號: CN113125747B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發(fā)明（設計）人: 馬振毅;劉喆;周瑞敏;殷曰苑;王國斌
• 申請（專利權）人: 天津醫(yī)科大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 北京知元同創(chuàng)知識產權代理事務所(普通合伙) 11535
• 代理人: 焦健;牛艷玲

本發(fā)明提供了體外篩選或檢測蛋白間相互作用的方法和檢測試劑盒及其應用。所述方法包括：1)構建含有第一標簽的cDNA文庫的第一重組表達載體；2)構建可表達含有第二標簽的待研究蛋白的第二重組表達載體；3)將第一重組表達載體和第二重組表達載體共轉染細胞，培養(yǎng)一段時間后將細胞進行固定；4)將步驟3)制備的固定后的細胞進行原位鄰近連接實驗(in situ proximity ligationassay,isPLA),然后分選isPLA陽性細胞；5)將步驟4)獲得的isPLA陽性細胞裂解后作為模板，根據(jù)第一重組表達載體的外源基因插入位點的上下游序列設計引物進行PCR擴增，然后將PCR產物進行測序，依據(jù)序列得出相互作用蛋白的氨基酸序列。

技術領域

本發(fā)明涉及蛋白質相互作用的檢測方法，具體涉及一種利用isPLA-Seq技術的高通量篩選和檢測蛋白質相互作用的方法和試劑盒及其應用。

背景技術

細胞的生理功能大多是由蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interactions,PPIs)介導的，因此對蛋白-蛋白互作的分子機制研究一直是生命科學和基礎醫(yī)學研究領域的重要內容。

目前，已經(jīng)開發(fā)了幾種篩選PPIs的實驗方法，包括酵母雙雜交、免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)和蛋白質譜聯(lián)用技術等，這些實驗技術有各自的優(yōu)缺點。

酵母雙雜交是一種比較傳統(tǒng)的成熟技術，具有培養(yǎng)成本較低，對培養(yǎng)條件要求不高的優(yōu)點，但其也存在不足之處，主要表現(xiàn)為：在酵母細胞中篩選誘餌蛋白的互作蛋白，可能和哺乳動物等來源的蛋白在生理狀態(tài)下的構象差別較大，從而會遺失部分真實的相互作用，同時還會導致較高的假陽性。

至于免疫共沉淀和質譜聯(lián)用技術，其優(yōu)點在于能夠真實反映細胞生理條件下的蛋白互作，不足之處在于難以反映細胞內特定的蛋白質瞬時構象，會丟掉一些互作蛋白，其次一些弱的瞬時互作也比較難以捕捉到，導致產生假陰性結果。此外，該技術對一些膜蛋白等可溶性差的蛋白并不適用，而且后期質譜鑒定對技術的要求比較高，依賴于昂貴的質譜分析儀和檢測靈敏度，也容易導致假陽性。

由于細胞內蛋白質構象處于動態(tài)變化中，這些現(xiàn)有技術對于一些瞬時蛋白-蛋白互作較難捕捉到，更不能高通量地檢測蛋白的相互作用。

發(fā)明內容

為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的主要目的在于提供一種體外檢測蛋白間相互作用的方法，該方法能夠在單個細胞中原位篩選相互作用的蛋白，可檢測瞬時相互作用，靈敏度高，假陽性率低；而且，所述方法可高通量地篩選相互作用的蛋白，成本低，效率高。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種檢測試劑盒，用于體外檢測蛋白間的相互作用。

本發(fā)明的又一目的在于提供上述體外檢測蛋白間相互作用的方法和檢測試劑盒的應用，所述應用為高通量篩選與待研究蛋白(或稱誘餌蛋白)相互作用的蛋白分子。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的一方面，提供了一種體外檢測蛋白間相互作用的方法，包括：

1)構建含有第一標簽的cDNA文庫的第一重組表達載體；

2)構建可表達含有第二標簽的待研究蛋白(或稱誘餌蛋白)的第二重組表達載體，所述第二標簽與第一標簽不同，所述第二重組表達載體與第一重組表達載體的出發(fā)載體相同或不同；

3)將第一重組表達載體和第二重組表達載體共轉染細胞，培養(yǎng)一段時間后將細胞進行固定；

4)將步驟3)制備的固定后的細胞進行原位鄰近連接實驗(in situ proximityligation assay,isPLA)，然后分選isPLA陽性細胞；