[發(fā)明專利]一種isPLA-Seq的高通量檢測蛋白質(zhì)相互作用的方法和試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110278036.6
• 申請日: 2021-03-15
• 公開（公告）號: CN113125747B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬振毅;劉喆;周瑞敏;殷曰苑;王國斌
• 申請（專利權(quán)）人: 天津醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 北京知元同創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11535
• 代理人: 焦健;牛艷玲

1.一種鑒定與待研究蛋白發(fā)生相互作用的蛋白的方法，其特征在于，包括：

1)構(gòu)建含有第一標(biāo)簽的cDNA文庫的第一重組表達(dá)載體；

2)構(gòu)建可表達(dá)含有第二標(biāo)簽的待研究蛋白的第二重組表達(dá)載體，所述第二標(biāo)簽與第一標(biāo)簽不同，所述第二重組表達(dá)載體的出發(fā)載體與第一重組表達(dá)載體的出發(fā)載體不同；

3)將第一重組表達(dá)載體和第二重組表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)一段時間后將細(xì)胞進(jìn)行固定；

4)將步驟3)制備的固定后的細(xì)胞進(jìn)行原位鄰近連接實(shí)驗(yàn)isPLA，然后分選isPLA陽性細(xì)胞；

5)將步驟4)獲得的isPLA陽性細(xì)胞裂解后作為PCR的模板，根據(jù)第一重組表達(dá)載體的外源基因插入位點(diǎn)的上下游序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，以鑒定與待研究蛋白可能發(fā)生相互作用的蛋白。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法進(jìn)一步包括步驟6)，利用重組克隆技術(shù)將步驟5)獲得的PCR產(chǎn)物構(gòu)建含有第一標(biāo)簽的陽性cDNA亞文庫，再重復(fù)步驟1)至5)，通過多輪篩選來逐步富集isPLA陽性細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟1)中，所述第一重組表達(dá)載體的出發(fā)載體是真核表達(dá)載體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一重組表達(dá)載體的出發(fā)載體是pcDNA3.1。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一標(biāo)簽為Flag或HA。

6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟2)中，所述第二重組表達(dá)載體的出發(fā)載體是真核表達(dá)載體。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述第二重組表達(dá)載體的出發(fā)載體是pCMV-HA。

8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第二標(biāo)簽為HA或Flag。

9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟5)中，上下游引物分別為：5’-GCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAAC-3’和5’-TGACACCTACTCAGACAATGCGATGC-3’。

10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞選自哺乳動物細(xì)胞。

11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為HEK293T細(xì)胞。

12.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟4)中，所述分選采用流式分析方法進(jìn)行或采用激光切割捕獲方法進(jìn)行。

13.一種鑒定與待研究蛋白發(fā)生相互作用的蛋白的試劑盒，包括：第一重組表達(dá)載體、第二重組表達(dá)載體和PCR引物對；所述第一重組表達(dá)載體包括帶第一標(biāo)簽的cDNA文庫；所述第二重組表達(dá)載體可表達(dá)帶第二標(biāo)簽的待研究蛋白；所述PCR引物對與第一重組表達(dá)載體的帶第一標(biāo)簽的cDNA插入位點(diǎn)的上下游序列互補(bǔ)；所述第一標(biāo)簽和第二標(biāo)簽不同；所述第一重組表達(dá)載體的出發(fā)載體和第二重組表達(dá)載體的出發(fā)載體不同；所述試劑盒還包括用于原位鄰近連接實(shí)驗(yàn)isPLA的試劑。

14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于，所述第一重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為pcDNA3.1，對應(yīng)的PCR引物對的上下游引物分別為：5’-GCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAAC-3’和5’-TGACACCTACTCAGACAATGCGATGC-3’。