[發明專利]一種篩選特異BCR/TCR的方法及其系統

有效

• 申請號: 202110273631.0
• 申請日: 2021-03-15
• 公開（公告）號: CN113122617B
• 公開（公告）日: 2023-07-14
• 發明（設計）人: 張志新;卓越;楊鑫
• 申請（專利權）人: 成都益安博生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6869;G16B20/30;G16B30/10;G16B40/10
• 代理公司: 成都極緯知識產權代理有限公司 51320
• 代理人: 梁鑫

本發明公開了一種篩選特異BCR/TCR的方法及其系統。該方法包括以下步驟：篩選特異性BCR/TCR的方法，包括以下步驟：(1)提取免疫后的待測樣本淋巴細胞中的mRNA；(2)逆轉錄處理步驟(1)所得mRNA后，再對其BCR/TCR可變區基因進行多重PCR擴增，然后進行高通量測序，并確定BCR/TCR可變區的核酸及氨基酸序列；(3)將測序得到的序列與未經抗原刺激樣本的淋巴細胞BCR/TCR測序結果對比，獲得相應的特異性免疫序列。本發明通過免疫圖譜大數據進行對比，同時比較巨大數量的BCR/TCR序列，具有更高的特異性和準確性，可以極大提高抗體及T細胞受體篩選鑒定的效率，且篩選成本低。

技術領域

本發明屬于分子生物學和細胞免疫學技術領域，具體涉及一種篩選特異性抗體(BCR)及T細胞受體(TCR)的方法及其系統。

背景技術

單克隆抗體，是由單一B細胞產生的高度均一、識別特定抗原表位的抗體。單克隆抗體在醫學與生物學基礎研究，以及臨床疾病的診斷、預防和治療中都有廣泛的應用前景。要得到針對特定抗原的單克隆抗體，需要進行抗體篩選。現有比較成熟的單克隆抗體篩選技術有：

1、雜交瘤技術。

將抗原免疫后的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞進行融合，形成的雜交細胞既可產生抗體，又可無限增殖。將融合的雜交細胞分成單細胞接種培養，通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)等方法篩選鑒定增殖后細胞分泌的抗體，找到能產生針對抗原具有高滴度抗體的細胞株，再從其中克隆出該抗體的基因序列。

雜交瘤技術的主要缺點是，后期鑒定過程需要進行大量重復性的培養、分離、鑒定實驗，帶來的是高昂的時間和物質成本。

2、噬菌體展示篩選技術。

將B淋巴細胞的抗體重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)采用PCR方法進行擴增，將擴增的片段插入到噬菌體載體中，抗體分子以Fab片段或者單鏈抗體(scFv)的形式，與單鏈噬菌體外殼蛋白形成融合蛋白，從而展示在噬菌體表面。之后將噬菌體轉染至宿主細胞中進行增殖，待成熟后釋放出來，最后利用抗原篩選的方法經過親和吸附、洗脫、擴增等步驟后即可獲得靶抗原特異性的噬菌體及對應單克隆抗體。

為了得到更接近人源抗體的抗體進行篩選，還有酵母表面展示技術、核糖體展示與mRNA展示篩選技術等，其方法與噬菌體展示篩選類似。各種展示技術篩選抗體的缺點與雜交瘤技術類似，后期鑒定過程工作量大，時間和物質成本高。

3、單細胞克隆技術。

先通過流式細胞分析等方法，篩選出表面受體能識別特定抗原的B淋巴細胞或T淋巴細胞。再直接從單個B細胞或T細胞中，克隆出它攜帶的B細胞受體(BCR，分泌到體外即為抗體)或T細胞受體(TCR)基因。

單克隆技術的缺點有兩方面：一方面，單個淋巴細胞表面的BCR或TCR數量有限，這就限制了利用抗原分選單細胞的靈敏度和特異性，分選出的細胞不能確保必然是陽性細胞，后期仍然需要對得到的抗體/TCR進行比較多的鑒定；另一方面，單細胞克隆的難度較高，對細胞的質量、操作人員的技能、試劑的品質都有很高要求。

現有單克隆抗體篩選技術還有三個顯著的不足：第一是對于人源抗體的篩選比較困難，因為無法像免疫動物一樣使用抗原和佐劑對人體進行反復免疫。如果使用轉基因小鼠(攜帶人源免疫球蛋白基因)，則成本會更高。這就使得制備人源抗體要么需要在篩選鑒定中投入更多資源，要么需要對動物抗體進行人源化。

第二是對針對復雜抗原制備單克隆抗體存在困難。當需要針對較大較復雜的抗原(如膜蛋白復合物、腫瘤細胞等)制備抗體時，選擇制備用于免疫的抗原本身就有較大難度且存在失敗風險，而免疫后也不能保證得到功能上滿足要求的抗體(如選擇多肽段免疫所得抗體，未必是中和抗體)。如果同時選取多種抗原進行免疫和篩選，則會顯著提高單克隆抗體制備的成本。

第三，需要確定抗原進行篩選鑒定