[發(fā)明專利]野化培訓(xùn)大熊貓免疫適應(yīng)的分子標(biāo)記評估方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110272777.3
• 申請日: 2021-03-12
• 公開（公告）號: CN112725471B
• 公開（公告）日: 2022-09-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃炎;楊苗;凌珊珊;沈海波;吳虹林;何鳴;張修月
• 申請（專利權(quán)）人: 中國大熊貓保護(hù)研究中心
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 成都佳劃信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 51266
• 代理人: 史姣姣

1.一種野化培訓(xùn)大熊貓免疫適應(yīng)的分子標(biāo)記評估方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、取待測野化培訓(xùn)大熊貓的血液組織樣本與圈養(yǎng)大熊貓組的血液組織樣本，分離出外周血單核細(xì)胞；

B、提取總RNA,再將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA;

C、然后向cDNA中添加qPCR Mix、專用引物、去離子水配置成qPCR反應(yīng)體系，qPCR反應(yīng)使用熒光PCR操作平臺；

D、使用2^???Ct方法計(jì)算每個(gè)Marker基因的表達(dá)水平；

E、基于T檢驗(yàn)獲得圈養(yǎng)大熊貓組每個(gè)Marker基因的2^???Ct置信區(qū)間；

F、將待測野化培訓(xùn)大熊貓樣本的每個(gè)Marker基因的2^???Ct值，與圈養(yǎng)大熊貓組對應(yīng)的置信區(qū)間進(jìn)行比較，若所有Marker基因的2^???Ct值大于置信區(qū)間的上限值，則認(rèn)為免疫適應(yīng)良好；

PCR擴(kuò)增用到的專用引物：

Marker1：正向引物 5’-GTGCAAGGGGACAGACGAAC-3’

反向引物 5’-CTTGAGTGTTTGCAGCCTTGGA-3’；

Marker2：正向引物 5’-GATAGACCCACGACTGCACC-3’

反向引物 5’-GGTCTCGCCTCTTTCACAGG-3’；

Marker3：正向引物 5’-CTGGCTGTTGCTCTCTTGGC-3’

反向引物 5’-ATGGTTTCTGTTTCTCAGCCCTCTT-3’；

Marker4：正向引物 5’-GAAGGTAAAAGTCGGGCCTGG-3’

反向引物 5’-GGCAGTTTTCTGCAGCTACTGTATG-3’

Marker5：正向引物 5’-CTACGACACGTCCACCGACA-3’

反向引物 5’-CCAAAGCCGCTGTTCTGGATG-3’；

Marker6：正向引物 5’-CGAGTCACCTACCAGGGCTA-3’

反向引物 5’-TCCGTGAACTCTGACTCCGT-3’；

所述評估方法非疾病的診斷和診療目的。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述野化培訓(xùn)大熊貓免疫適應(yīng)的分子標(biāo)記評估方法，其特征在于，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的內(nèi)參基因的引物為：

正向引物 5’-GGTATGACAACGAATTTGGCTACA-3’

反向引物 5’-GATGGAAACAGTGGAGGTCAGGA-3’。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述野化培訓(xùn)大熊貓免疫適應(yīng)的分子標(biāo)記評估方法，其特征在于，所述樣本基因的2^???Ct的計(jì)算方法為：

D1、每個(gè)樣本按步驟B和C進(jìn)行三次，取三次Ct值的平均值，待測Marker基因Ct值的平均值-內(nèi)參基因Ct值的平均值獲得待測Marker基因表達(dá)量ΔCt；

D2、計(jì)算每個(gè)樣品中待測Marker基因的2^??Ct值；

D3、計(jì)算圈養(yǎng)大熊貓組的2^??Ct的均值，用樣本2^??Ct值/圈養(yǎng)組2^??Ct均值，得到每個(gè)樣本待測Marker基因的2^???Ct值。