[發明專利]一種表達雙報告標簽的重組副流感病毒5型

在審

• 申請號: 202110272641.2
• 申請日: 2021-03-13
• 公開（公告）號: CN113025631A
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 劉拂曉;王遷遷;單虎
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N15/45
• 分類號: C12N15/45;C12N7/01;C12N15/62;C12N15/11
• 代理公司: 北京識然知識產權代理事務所(普通合伙) 11975
• 代理人: 曾慶國

本發明的目的是提供一種共表達增強型綠色熒光蛋白(eGFP)和NanoLuc熒光素酶(NLuc)的重組副流感病毒5型(PIV5)，其中用于拯救共表達eGFP和NLuc的重組PIV5核酸片段的結構為5′?NP?V/P?eGFP?T2A?NLuc?M?F?SH?HN?L?3′；其中NP、V/P、M、F、SH、HN和L為PIV5的自身基因；eGFP?T2A?NLuc為融合序列；其中T2A為自剪切肽序列，負責“切斷”eGFP和NLuc，將二者分離。本發明通過反向遺傳技術拯救的重組PIV5，既不能導致MDBK細胞病變，也不能誘導空斑形成，但對于eGFP和NLuc的表達水平較高。重組PIV5的生長動力學與NLuc的表達動力學呈正相關。eGFP?T2A?NLuc融合序列在重組PIV5連續20次傳代過程中基因較為穩定。

技術領域

本發明屬于重組病毒構建技術領域，具體涉及一種表達雙報告標簽的重組副流感病毒5型。

背景技術

副流感病毒5型(parainfluenza virus 5，PIV5)，舊稱“猴病毒5型”，屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)、正腮腺炎病毒屬(Orthorubulavirus)成員。PIV5基因組為單股、負鏈、線性的RNA，全長15246nt，包含七個非重疊基因，順序依次為3′-NP-V/P-M-F-SH-HN-L-5′，其中P基因包含V基因，對應編碼V蛋白(非結構蛋白)。病毒經純化后電鏡下觀察形狀不定，但多呈球形或橢球形，外披脂質囊膜，囊膜外表面嵌有鉚釘狀纖突。囊膜內表面緊鄰基質蛋白，其單體之間相互作用構成了整個病毒的外骨架，內部則含有鯡魚骨狀螺旋型核衣殼。

PIV5可感染多種哺乳動物，如牛、豬、犬等，也包括能感染人。該病毒除了引起狗的犬窩咳之外，通常不能導致其他易感動物表現出臨床癥狀。另外，PIV5可感染多種細胞系，如Vero細胞、BHK細胞、MDBK細胞等，但通常不引起或只引起輕微的細胞病變，這便在多個方面限制了PIV5的應用，如病毒滴度測定。而表達熒光標簽的重組PIV5，由于具有實時熒光指示作用，因此可以解決野生型病毒不誘導細胞病變所帶來的限制。

發明內容

本發明目的是提供一種共表達增強型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescence protein，eGFP)和NanoLuc螢光素酶(NanoLuc luciferase,NLuc)的重組副流感病毒5型PIV5(rPIV5-GN)，從而彌補現有技術的不足。

本發明首先提供一種用于拯救共表達eGFP和NLuc的重組PIV5核酸片段(rPIV5-GNcDNA clone)，所述核酸片段的結構如下：5′-NP-V/P-eGFP-T2A-NLuc-M-F-SH-HN-L-3′；其中，NP、V/P、M、F、SH、HN、L為PIV5病毒的自身基因；eGFP-T2A-NLuc為插入的融合序列；eGFP-T2A-NLuc的上游包含M基因起始序列(M GS)和Pme I酶切位點，下游包含Not I酶切位點及V/P基因終止序列(V/P GE)；

作為實施例的一種具體記載，所述重組PIV5核酸片段的序列為SEQ IDNO:1；

本發明所提供的核酸片段用于在細胞內拯救能夠共表達eGFP和NLuc的重組副流感病毒5型；

所述的細胞為BSR-T7/5細胞和Madin-Darby bovine kidney(MDBK)細胞，兩者分別用于重組病毒的拯救和傳代；

本發明再一個方面提供一種能夠共表達eGFP和NLuc的重組副流感病毒5型，所述的病毒是使用共表達eGFP和NLuc的重組PIV5核酸片段的重組質粒在細胞內拯救獲得的。

本發明還提供用于檢測所述的重組副流感病毒5型的引物對，其上游引物的序列為5′-GCAATCATCCGCAGTGCAATTTGA-3′；

下游引物的序列為5′-TGCGGGAATGCTGATGGATGGCAT-3′。