[發(fā)明專利]一種沉積物石蠟切片的制作方法

有效

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• 申請日: 2021-03-12
• 公開（公告）號: CN112816512B
• 公開（公告）日: 2022-11-01
• 發(fā)明（設計）人: 許玫英;王斌;黃友達
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省科學院微生物研究所（廣東省微生物分析檢測中心）
• 主分類號: G01N23/2202
• 分類號: G01N23/2202;G01N23/2251
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 朱雙;劉明星

本發(fā)明公開了一種沉積物石蠟切片的制作方法。本方法先用戊二醛固定沉積物樣本，然后經(jīng)過梯度乙醇脫水、透明處理、浸蠟包埋、切片、烤片，烤片后迅速用聚乙烯醇縮甲醛處理及用離子加濕器吹掃，這可以在切片表面形成一層膜，從而將切片細節(jié)保護在內(nèi)。本方法切出的沉積物切片，結(jié)構(gòu)完整，顯示清晰，對觀察微生物中微生物形態(tài)結(jié)構(gòu)等具有明顯的增強效果。

技術(shù)領域

本發(fā)明屬于石蠟切片的制作領域，具體涉及一種沉積物石蠟切片的制作方法。

背景技術(shù)

沉積物是水體中重要的環(huán)境信息載體，包含豐富的礦物質(zhì)、有機質(zhì)以及微生物等。微生物是沉積物中生物量最大的類群，其形態(tài)、結(jié)構(gòu)及其生長環(huán)境等是影響其環(huán)境生態(tài)行為的重要因素，因此，對沉積物中微生物進行原位觀察就顯得尤為重要，沉積物切片可以較好地實現(xiàn)這個目標，然而相關的技術(shù)較為缺乏。

沉積物切片目前主要以冰凍切片為主，但目前冰凍切片技術(shù)主要應用于常規(guī)動植物組織等，由于沉積物顆粒的粘連性較差，遠遠低于常規(guī)動植物組織的粘連性，因此沉積物冰凍切片一般較脆，容易破碎，而且冰凍切片在進行掃描電鏡觀察時受沉積物介質(zhì)的影響較大，難以觀察到較清晰的微生物形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

石蠟切片是目前應用得最廣泛的組織學常規(guī)制片技術(shù)，一般用來觀察細胞組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，可長期保存。目前尚未有研究將石蠟切片技術(shù)應用于沉積物這種介質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種沉積物石蠟切片的制作方法，用于后續(xù)的掃描電鏡成像觀察與研究。本發(fā)明通過將石蠟切片引入沉積物中微生物的掃描電鏡成像中，以此觀察沉積物中的微生物，尤其是長線狀微生物。

本發(fā)明的沉積物石蠟切片的制作方法，包括以下步驟：

a.取樣：用吸管插取沉積物柱狀樣本，然后用液氮速凍；

b.固定：切開并移除吸管，加入體積分數(shù)2.5％戊二醛水溶液固定沉積物柱狀樣本，在黑暗中固定過夜；

c.浸洗：用pH7.2的0.1M PBS溶液浸洗固定后的樣本三次；

d.脫水：用梯度乙醇脫水處理；

e.透明處理：先用體積比為1:1的二甲苯/乙醇處理一次，再用二甲苯處理兩次；

f.浸蠟包埋：用65℃的石蠟浸蠟處理三次，然后置于包埋盒中冰上包埋；

g.二次包埋：將包埋后的沉積物塊修整至切面小于8mm×8mm，隨后重復一次步驟f的操作進行二次包埋；

h.修塊及切片：將切面修整至小于1cm×1cm后，使用手動輪轉(zhuǎn)式病理切片機連續(xù)切片，并在40℃水浴中進行展片，再用多聚賴氨酸包埋的細胞爬片進行貼片；

i.烤片：將切片豎直置于65℃烘箱中烤片；

j.貼膜：將切片在體積分數(shù)0.3％的聚乙烯醇縮甲醛水溶液中蘸一下，然后用離子加濕器吹切片使其在表面形成一層微孔濾膜；

k.脫蠟：用二甲苯脫蠟兩次；

l.置換：用乙醇置換二甲苯兩次，然后用叔丁醇置換二甲苯一次；

m.用冷凍干燥機凍干樣本，然后進行掃描電鏡觀察。

優(yōu)選，所述的步驟c的浸洗，每次10min；

優(yōu)選，所述的步驟d的用梯度乙醇脫水處理，是依次用體積分數(shù)70％乙醇水溶液、體積分數(shù)85％乙醇水溶液、體積分數(shù)95％乙醇水溶液、乙醇、乙醇進行脫水處理，每次脫水處理30min。

優(yōu)選，所述的步驟e，具體為：先用體積比為1:1的二甲苯/乙醇處理30min，再用二甲苯處理兩次，每次30min