[發明專利]一種表達β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 202110270376.4
• 申請日: 2021-03-12
• 公開（公告）號: CN113151026A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 朱佑民;鐘誠;于婷婷;張慧;鄭業鴻;雷雨;孟維龍;張文薈;林莉莉
• 申請（專利權）人: 上海國龍生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/62;C12N15/81;C12N9/42;C12N9/40;A23K10/14;A23K20/189;C12R1/84
• 代理公司: 南京禾易知識產權代理有限公司 32320
• 代理人: 張松云

本發明提出了一種表達β?甘露聚糖酶和α?半乳糖苷酶的畢赤酵母的制備方法，包括如下步驟：S1、化學合成β?甘露聚糖酶和α?半乳糖苷酶的基因序列；S2、酶切S1中所述基因序列并與酶切線性化的畢赤酵母表達載體分別連接或重組，得基因表達質粒；S3、將S2中構架好的基因表達質粒酶切線性化后分別或混合轉化入畢赤酵母感受態細胞中；S4、通過His缺陷、G418抗性以及PCR方法篩選出分別或同時含有基因的陽性克隆菌株，得到能夠分別或同時表達β?甘露聚糖酶和α?半乳糖苷酶的畢赤酵母；所述β?甘露聚糖酶以及α?半乳糖苷酶的核苷酸序列兩端包含EcoRI和Not1酶切位點序列和載體pPIC9K的同源臂序列。本發明通過β?甘露聚糖酶和α?半乳糖苷酶配合使用可以更加徹底地降解半乳甘露聚糖。

技術領域

本發明涉及一種表達β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母的制備方法及其應用。

背景技術

半乳甘露聚糖是一種包含了甘露糖骨干與半乳糖旁基的多糖，是一種抗營養因子，其抗營養作用的主要原因是溶于水后具有的高度粘性。由于動物體內不能產生降解半乳甘露聚糖的酶類，動物采食半乳甘露聚糖含量高的食物后，增加了腸道食糜的粘度，降低了胃腸道運動對食糜的混合效率，從而阻礙酶對飼料的消化和養分的吸收。

現有技術通過單一的酶如β-甘露聚糖酶消除抗營養因子半乳甘露聚糖，但是，β-甘露聚糖酶只能水解甘露糖骨干的1,4連接鍵，不能水解1,6鍵連接的半乳糖殘基，水解產物很大一部分不是單糖或寡糖。營養物質不能充分被吸收利用造成了食物的浪費，也使得動物覓食后長不快。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有技術存在的缺陷，本發明提出了一種表達β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母的制備方法及其應用，β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶配合使用既可以水解甘露糖骨干的1,4連接鍵，又能水解1,6鍵連接的半乳糖殘基，水解產物是單糖或寡糖，可以被動物充分吸收利用。β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶配合使用作為飼料添加劑可以加快動物生長。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種表達β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母的制備方法，包括如下步驟：

S1、化學合成如SEQ ID No.1所示的β-甘露聚糖酶和如SEQ ID No.2所示的α-半乳糖苷酶的基因序列；

S2、酶切S1中所述β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的基因序列并與酶切線性化的畢赤酵母表達載體分別連接或重組，得β-甘露聚糖酶基因表達質粒和α-半乳糖苷酶基因表達質粒；

S3、將S2中構建好的β-甘露聚糖酶基因表達質粒和α-半乳糖苷酶基因表達質粒酶切線性化后分別或混合轉化入畢赤酵母感受態細胞中；

S4、通過His缺陷和G418抗性篩選出有基因插入的畢赤酵母菌，然后通過PCR方法篩選出分別或同時含有β-甘露聚糖酶基因和α-半乳糖苷酶基因的陽性克隆菌株，得到能夠分別或同時表達β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的畢赤酵母；

所述β-甘露聚糖酶以及α-半乳糖苷酶的核苷酸序列兩端包含EcoRI和Not1酶切位點序列和載體pPIC9K的同源臂序列。

進一步地，所述S2中β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的基因序列與酶切線性化的畢赤酵母表達載體通過T4連接酶或2X ClonExpress Mix連接或重組。

進一步地，所述S3中表達質粒采用Sacl酶切線性化。

進一步地，所述表達質粒線性化后跑1％的agarose瓊脂糖凝膠確認重組質粒完全線性化。

進一步地，將完全線性化的所述表達質粒等量或等比例混合后，轉化入畢赤酵母感受態細胞中，200-240rpm條件下進行搖床培養1h。